CRISPR/Cas9-mediated efficient editing in phytoene desaturase (PDS) demonstrates precise manipulation in banana cv. Rasthali genome
- 作者
- Navneet Kaur, Anshu Alok, Shivani, Navjot Kaur, Pankaj Pandey, Praveen Awasthi, Siddharth Tiwari
- 单位
- National Agri-Food Biotechnology Institute (NABI), Department of Biotechnology, Ministry of Science and Technology (Government of India), Sector 81, Knowledge City, S.A.S. Nagar, Mohali 140306, Punjab, India; Department of Biotechnology, Panjab University, Chandigarh 160014, India
- 杂志
- Functional & Integrative Genomics（2017）
- DOI
- 10.1007/s10142-017-0577-5
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在香蕉（cv. Rasthali）基因组中实现高效精确的基因编辑，以八氢番茄红素脱氢酶（PDS）为靶标验证CRISPR/Cas9系统的可行性和效率。
研究策略
分离Rasthali中两个PDS同源基因（RAS-PDS1和RAS-PDS2），进行序列与系统发育分析；设计靶向二者保守区的19-bp gRNA，构建CRISPR/Cas9载体（CRISPR_RAS_PDS）；通过农杆菌介导转化胚性细胞悬浮系（ECS），再生植株后通过测序检测突变，并分析表型及色素含量。
核心内容
该研究在香蕉品种Rasthali中建立了CRISPR/Cas9基因组编辑体系，首次成功实现对内源八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因的精准敲除。作者分离了两个PDS同源基因RAS-PDS1和RAS-PDS2，通过序列比对设计了一个靶向其保守区的19-bp gRNA，构建CRISPR/Cas9载体后经农杆菌介导转化胚性细胞悬浮系并再生植株。在22个PCR阳性植株中，13个确认发生indel突变，突变效率达59%。突变类型包括1、2、5个核苷酸的插入和1、2、4、38个核苷酸的缺失，均位于PAM邻近区域并导致移码及提前终止密码子的产生。突变体白化或嵌合表型明显，叶绿素a、叶绿素b及总类胡萝卜素含量较对照显著降低。结果表明单个gRNA可同时靶向两个PDS同源基因实现高效编辑，PDS可作为可视筛选标记，该体系为香蕉功能基因组研究和遗传改良提供了可靠工具。
创新点
首次在香蕉品种Rasthali中成功利用CRISPR/Cas9系统编辑内源PDS基因；利用单个gRNA同时靶向两个PDS同源基因；获得了59%的突变效率，并通过表型（白化/嵌合）和色素含量变化确认基因功能破坏。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 香蕉cv. Rasthali胚性细胞悬浮系（ECS） | 类胡萝卜素生物合成途径 | RAS-PDS1 (GenBank: MF574096) | Phytoene desaturase (PDS) | 催化 | 靶向编辑的八氢番茄红素脱氢酶，催化八氢番茄红素脱氢生成ζ-胡萝卜素 |
| 香蕉cv. Rasthali胚性细胞悬浮系（ECS） | 类胡萝卜素生物合成途径 | RAS-PDS2 (GenBank: MF574097) | Phytoene desaturase (PDS) | 催化 | RAS-PDS1的同源基因，与RAS-PDS1有97%相似性，也作为编辑靶点 |
| 香蕉cv. Rasthali胚性细胞悬浮系（ECS） | CRISPR/Cas9系统 | Cas9 | Cas9核酸内切酶 | 催化 | 由双CaMV 35S启动子驱动，在靶位点产生双链断裂，诱导NHEJ修复 |
关键发现
- 在22个PCR阳性植株中，13个确认发生 indel 突变，突变频率为59%
- 插入类型包括1、2、5个核苷酸（分别见于2、2、3个株系），缺失类型包括1、2、4、38个核苷酸（分别见于1、2、1、1个株系），另1个株系同时有5-bp插入和1-bp缺失
- 突变均位于PAM（AGG）邻近区域，导致移码并产生提前终止密码子
- 突变体叶绿素a、叶绿素b及总类胡萝卜素含量较对照显著降低。
研究结论
CRISPR/Cas9系统可有效用于香蕉cv. Rasthali基因组的精确编辑，PDS基因可作为可视标记，该技术为香蕉功能基因组研究和遗传改良提供了有力工具。