Overexpression of ORCA3 and G10H in Catharanthus roseus Plants Regulated Alkaloid Biosynthesis and Metabolism Revealed by NMR-Metabolomics
- 作者
- Qifang Pan, Quan Wang, Fang Yuan, Shihai Xing, Jingya Zhao, Young Hae Choi, Robert Verpoorte, Yuesheng Tian, Guofeng Wang, Kexuan Tang
- 单位
- Plant Biotechnology Research Center, SJTU-Cornell Institute of Sustainable Agriculture and Biotechnology, Fudan-SJTU-Nottingham Plant Biotechnology R&D Center, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, People's Republic of China; Natural Products Laboratory, Institute of Biology Leiden, Leiden University, Leiden, The Netherlands
- 杂志
- PLoS ONE（2012）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0043038
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
通过基因工程提高长春花中抗癌二聚吲哚生物碱的产量，并解析ORCA3和G10H过表达对单萜吲哚生物碱（MIA）生物合成及整体代谢的调控作用。
研究策略
将ORCA3单独或与G10H共同过表达于长春花植株，利用实时PCR分析基因转录水平，HPLC测定生物碱含量，并结合NMR代谢组学与多变量数据分析比较转基因与对照的整体代谢差异。
研究路线图
核心内容
该研究在长春花整株植株中过表达转录因子ORCA3及结构基因G10H，以提升单萜吲哚生物碱产量。通过实时PCR分析转录水平、HPLC测定生物碱含量，并结合NMR代谢组学与多变量数据比较转基因与对照的整体代谢差异。结果显示，ORCA3过表达上调了AS、TDC、STR和D4H的转录，但与G10H共表达时才显著提高G10H转录。OR和GO系中文多灵含量最高分别达2.83和3.00 mg/g DW，长春质碱最高达5.79和5.36 mg/g DW，均高于对照；GO系中异胡豆苷相对含量为对照的3.25倍。然而，二聚生物碱仅在一个OR系中显著升高（脱水长春碱达10.25 mg/g DW，长春碱达0.27 mg/g DW）。NMR代谢组学还揭示氨基酸、有机酸、糖及苯丙烷类代谢物发生广泛变化。这表明过表达ORCA3和G10H可显著提高单体生物碱积累，但二聚生物碱合成受细胞类型和区室化限制，且MIA途径增强会重塑植物全局代谢网络。
创新点
首次在长春花整株植株中过表达ORCA3和G10H（而非细胞或毛状根），结合NMR代谢组学系统评估了转录因子与结构基因过表达对单萜吲哚生物碱及整体代谢网络的影响。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 长春花（Catharanthus roseus） | 单萜吲哚生物碱生物合成调控 | ORCA3 | ORCA3 (AP2/ERF转录因子) | 调控 | 调控AS、TDC、STR、D4H等基因表达 |
| 长春花（Catharanthus roseus） | 类萜（环烯醚萜）途径 | G10H | 香叶醇10-羟化酶 (geraniol 10-hydroxylase) | 催化 | 催化香叶醇羟基化为10-羟基香叶醇 |
| 长春花（Catharanthus roseus） | 吲哚途径 | AS (As2) | 邻氨基苯甲酸合酶 (anthranilate synthase) | 催化 | 催化分支酸生成邻氨基苯甲酸 |
| 长春花（Catharanthus roseus） | 吲哚途径 | TDC | 色氨酸脱羧酶 (tryptophan decarboxylase) | 催化 | 催化色氨酸脱羧生成色胺 |
| 长春花（Catharanthus roseus） | 单萜吲哚生物碱生物合成 | STR | 异胡豆苷合酶 (strictosidine synthase) | 催化 | 催化色胺与裂环马钱素缩合生成异胡豆苷 |
| 长春花（Catharanthus roseus） | 文多灵生物合成 | D4H | 脱乙酰氧基文多灵4-羟化酶 (desacetoxyindoline 4-hydroxylase) | 催化 | 文多灵合成后期的羟化酶 |
| 长春花（Catharanthus roseus） | MEP途径 | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 (1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase) | 催化 | MEP途径限速酶 |
| 长春花（Catharanthus roseus） | 茉莉酸信号通路 | CRMYC2 | CrMYC2 (bHLH转录因子) | 调控 | 调控ORCA基因表达 |
关键发现
- ORCA3过表达上调AS、TDC、STR和D4H转录，但不影响CRMYC2和G10H
- G10H与ORCA3共表达显著提高G10H转录。OR和GO系中vindoline含量分别达0.78–2.83 mg/g DW和1.25–3.00 mg/g DW（对照0.70 mg/g DW），catharanthine分别为3.65–5.79和3.78–5.36 mg/g DW（对照1.99 mg/g DW），ajmalicine分别为0.07–0.10和0.14–0.49 mg/g DW（对照0.05 mg/g DW）。OR43系anhydrovinblastine达10.25 mg/g DW（1.08倍上调），vinblastine达0.27 mg/g DW（10.19倍上调）。NMR代谢组学显示氨基酸、有机酸、糖及苯丙烷类代谢物在转基因系中发生变化，且GO系中strictosidine相对含量为对照的3.25倍（p=0.000），vindoline为2.82倍（p=0.000）。
研究结论
过表达ORCA3和G10H显著提高长春花植株中单体吲哚生物碱（异胡豆苷、文多灵、长春质碱和阿吗碱）的积累，但对二聚生物碱（脱水长春碱和长春碱）影响有限；过表达还引起初级代谢和苯丙烷代谢的广泛变化，表明MIA生物合成的增强会重塑植物全局代谢，且二聚生物碱的合成受到细胞类型和区室化的进一步限制。