Generation of an evolved Saccharomyces cerevisiae strain with a high freeze tolerance and an improved ability to grow on glycerol
- 作者
- Annamaria Merico, Enrico Ragni, Silvia Galafassi, Laura Popolo, Concetta Compagno
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2010）
- DOI
- 10.1007/s10295-010-0878-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
野生型酿酒酵母在合成甘油培养基上生长缓慢或不能生长，需要改良菌株以利用廉价甘油并提高冻融耐受性。
研究策略
采用进化工程策略，通过在甘油合成培养基上连续传代培养，筛选获得在甘油上生长改善的突变株MG16C。
核心内容
该研究以酿酒酵母CEN.PK 113-7D为出发菌株，针对其在合成甘油培养基上生长缓慢甚至不能生长的问题，采用进化工程策略，通过在甘油合成培养基上连续传代筛选，获得了能在甘油上快速生长的突变株MG16C。结果显示，野生型菌株在合成甘油培养基上需经历3至5周停滞期，添加0.05%蛋白胨后停滞消除且比生长速率从0.060 h⁻¹提升至0.110 h⁻¹；而进化菌株MG16C在甘油上的比生长速率达0.17 h⁻¹，约为野生型的3倍，甘油消耗速率达到7.34 mmol g⁻¹ h⁻¹，远高于野生型的3.44。值得注意的是，MG16C经-20℃冻存30天后存活率达80%，而野生型在葡萄糖培养基上仅为23%。酶活性分析显示，MG16C中Gpd1p活性降至1.4 mU/mg，而野生型为38.2 mU/mg，但Gut1p和Dak1p/Dak2p活性基本不变。该结果表明，通过简单进化工程即可同时赋予菌株甘油利用能力和高冻融耐受性，其机制可能与降低Gpd1p活性减少无效循环有关，该策略可推广至其他工业酵母性状的改良。
创新点
通过简单的进化工程获得了能在合成甘油培养基上快速生长的酿酒酵母突变株，该菌株同时具备高冻融耐受性，并初步揭示了其与Gpd1p活性降低相关的可能机制。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D | 甘油代谢 | GUT1 | Gut1p | 催化 | 甘油激酶，将甘油磷酸化为甘油-3-磷酸 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D | 甘油代谢/NADH穿梭 | GUT2 | Gut2p | 催化 | 线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，参与甘油利用和胞质NADH再氧化 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D | 甘油代谢/NADH穿梭 | GPD1 | Gpd1p | 催化 | 胞质甘油-3-磷酸脱氢酶，MG16C中活性显著降低，减少无效循环 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D | 甘油替代途径 | DAK1/DAK2 | Dak1p/Dak2p | 催化 | 二羟丙酮激酶，磷酸化二羟丙酮 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D | 甘油转运 | STL1 | Stl1p | 转运 | 甘油/H+同向转运体，主动摄取甘油 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D | 甘油转运 | FPS1 | Fps1p | 转运 | 甘油通道蛋白，介导甘油被动扩散 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D | 线粒体呼吸链 | NDE1/NDE2 | Nde1p/Nde2p | 能量供给 | 线粒体外部NADH脱氢酶，氧化胞质NADH，与Gut2p形成复合物 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D | 糖酵解/糖异生 | TPI1 | Tpi1p | 催化 | 磷酸丙糖异构酶，与Gpd1p竞争DHAP |
关键发现
- 野生型菌株在甘油合成培养基上需3-5周长停滞期，添加0.05%蛋白胨后停滞消失且比生长速率从0.060 h^-1提高到0.110 h^-1
- 进化菌株MG16C在甘油上比生长速率达0.17 h^-1（约为野生型0.06的3倍），甘油消耗速率为7.34 mmol g^-1 h^-1（野生型3.44）
- MG16C经-20℃冻存30天后存活率80%，野生型在葡萄糖培养基上仅23%
- MG16C中Gpd1p（Gdpd）活性降至1.4 mU/mg（野生型38.2），而Gut1p和Dak1p/Dak2p活性基本不变。
研究结论
通过进化工程成功获得酿酒酵母突变株MG16C，其在甘油合成培养基上的生长性能显著改善，且保持发酵能力；在甘油培养基上培养后具有高冻融耐受性，可能通过降低Gpd1p活性减少甘油代谢中的无效循环，从而促进甘油利用。该策略可推广至获得其他工业相关性状的酵母菌株。