Molecular Breeding of a Fungus Producing a Precursor Diterpene Suitable for Semi-Synthesis by Dissection of the Biosynthetic Machinery
- 作者
- Motoyoshi Noike, Yusuke Ono, Yuji Araki, Ryo Tanio, Yusuke Higuchi, Hajime Nitta, Yoshimitsu Hamano, Tomonobu Toyomasu, Takeshi Sassa, Nobuo Kato, Tohru Dairi
- 单位
- Graduate School of Engineering, Hokkaido University; The institute of Scientific and Industrial Research, Osaka University; Department of Bioscience, Fukui Prefectural University; Department of Bioresource Engineering, Yamagata University
- 杂志
- PLoS ONE（2012）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0042090
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过理性改造真菌生产适合半合成抗癌药物的二萜前体FC H（10），以替代低效、复杂的化学合成路线。
研究策略
解析Phomopsis amygdali中FC A生物合成基因簇，通过酶学表征明确各步反应底物特异性，鉴定并敲除负责12-羟化的P450基因（orf10），使突变株积累关键中间体FC H（10）。
研究路线图
核心内容
该研究通过解析Phomopsis amygdali中fusicoccin A（FC A）的生物合成基因簇，利用理性基因敲除策略构建了高效积累关键二萜前体FC H（10）的真菌突变株，以替代低效的化学合成路线。研究者克隆并鉴定了FC A生物合成的第二基因簇（21 kbp，含9个基因），通过酶动力学表征明确了各修饰酶的底物特异性，包括甲基转移酶Orf8、乙酰转移酶Orf12、糖基转移酶Orf6等，证明这些酶具有严格底物选择性。基于此机制解析，敲除负责12-羟化的P450基因orf10后，突变株以FC H为唯一主要代谢产物，产量达0.6 g/L，与野生型FC相关化合物总产量相当；敲除orf13则主要积累FC J。该化合物易于结晶，可便捷转化为抗癌药物。这一基于生物合成机制解析的定向育种策略，相较于传统随机诱变更具精准性，且可推广至其他真菌天然产物的半合成前体生产，为复杂二萜类药物的工业化制备提供了可行途径。
创新点
基于生物合成机制解析的定向基因敲除育种策略，替代传统随机诱变；通过酶动力学证明系列酶具有严格底物特异性，从而保证突变株单一产物积累；所得FC H易于结晶且产量与野生型产总量相当。
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Phomopsis amygdali | fusicoccin A生物合成 | orf1 (PaFS) | 嵌合二萜合酶 PaFS | 催化 | 兼具GGPP合酶和二萜环化酶活性，催化形成fusicocca-2,10(14)-diene骨架 |
| Phomopsis amygdali | fusicoccin A生物合成 | orf2 | α-酮戊二酸依赖性双加氧酶 | 催化 | 催化6的16-氧化，可能也参与后续氧化 |
| Phomopsis amygdali | fusicoccin A生物合成 | orf3 | P450-1 | 催化 | 催化16-羟化，与brassicicene生物合成中BC-Orf7类似 |
| Phomopsis amygdali | fusicoccin A生物合成 | orf4 | 短链脱氢酶/还原酶 | 催化 | 催化醛还原，参与6→8转化 |
| Phomopsis amygdali | fusicoccin A生物合成 | orf5 | P450-2 | 催化 | 催化4的8-羟化生成5 |
| Phomopsis amygdali | fusicoccin A生物合成 | orf6 | 糖基转移酶 | 催化 | 催化9的8β-羟基糖基化生成10，Km(9)=44 μM，kcat=0.40 s⁻¹ |
| Phomopsis amygdali | fusicoccin A生物合成 | orf7 | P450-3 | 催化 | 催化8的9-羟化生成9 |
| Phomopsis amygdali | fusicoccin A生物合成 | orf8 | 甲基转移酶 | 催化 | 催化11的16-位甲基化；对10的Km=17 μM，kcat=0.043 s⁻¹ |
| Phomopsis amygdali | fusicoccin A生物合成 | orf9 | 膜结合乙酰转移酶 | 催化 | 推测催化14的19-位乙酰化，但未获得异源表达 |
| Phomopsis amygdali | fusicoccin A生物合成 | orf10 | P450-4 | 催化 | 催化12-羟化；敲除后突变株主要积累10 |
| Phomopsis amygdali | fusicoccin A生物合成 | orf11 | 异戊烯基转移酶 | 催化 | 催化12的6'-羟基O-异戊烯化生成13；对12的kcat/Km比10高50倍 |
| Phomopsis amygdali | fusicoccin A生物合成 | orf12 | 乙酰转移酶-2 | 催化 | 催化15的3'-位乙酰化生成1；对14的Km=170 μM，kcat=3.5×10⁻³ s⁻¹ |
| Phomopsis amygdali | fusicoccin A生物合成 | orf13 | P450-5 | 催化 | 催化19-羟化；敲除后突变株主要积累13 |
| Phomopsis amygdali | fusicoccin A生物合成 | pafp (orf11同义) | 异戊烯基转移酶 | 催化 | 与orf11相同，可催化反式异戊烯基转移 |
| Saccharomyces cerevisiae | 异源表达体系 | 细胞色素P450还原酶基因 | 细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 为P450酶提供电子，用于异源功能分析 |
关键发现
- 克隆并解析了FC A生物合成第二基因簇（21 kbp，含9个基因）
- 敲除orf10的突变株以FC H（10）为唯一主要代谢产物，产量为0.6 g/L，与野生型FC相关化合物总产量相当
- 敲除orf13的突变株主要积累FC J（13）
- 甲基转移酶Orf8对10的Km=17±1.8 μM、对SAM Km=56±6.0 μM、kcat=0.043±0.0016 s⁻¹
- 乙酰转移酶Orf12对14的Km=170±4.0 μM、kcat=3.5×10⁻³ s⁻¹
- 糖基转移酶Orf6对9的Km=44±8.1 μM、对UDP-葡萄糖Km=520±46 μM、kcat=0.40±0.044 s⁻¹
- 异戊烯基转移酶Orf11对12的kcat/Km比10高50倍。
研究结论
通过解析生物合成机制并敲除12-羟化酶基因，成功构建了高效积累FC H的突变株，该化合物可方便地转化为抗癌药物，且该策略可推广至其他真菌天然产物的半合成前体生产。