High-cell-density fermentation and pilot-scale biocatalytic studies of an engineered yeast expressing the heterologous glycoside hydrolase of 7-β-xylosyltaxanes
- 作者
- Wen-Bo Yu, Xiao Liang, Ping Zhu
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1007/s10295-012-1212-z
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
7-β-木糖基紫杉烷类化合物（如XDT及其类似物）中C-7位木糖的去除效率低，化学法特异性差、污染环境，生物法酶量不足，需要开发高效、可规模化的酶促转化方法，以获得用于紫杉醇半合成的7-β-羟基紫杉烷。
研究策略
构建胞内表达LXYL-P1-2的重组毕赤酵母GS115-3.5K-P1-2，优化高细胞密度发酵条件（初始细胞密度和诱导期溶氧水平），获得高生物量和高酶活；将冻干细胞作为催化剂，在5 L规模下进行底物（10 g/L 7-β-木糖基紫杉烷）的生物转化，并通过乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析和制备型HPLC纯化产物。
核心内容
本研究针对7-β-木糖基紫杉烷类化合物中C-7位木糖去除效率低、生物法酶量不足的问题，构建了胞内表达LXYL-P1-2糖苷水解酶的重组毕赤酵母GS115-3.5K-P1-2，并对其高细胞密度发酵和规模化生物转化进行了系统研究。通过优化初始细胞密度至300 g/L并将诱导期溶氧控制在5%，发酵获得最大湿重312.3 g/L，生物量酶活达6.55×10⁴ U/g，体积酶活达2.05×10⁷ U/L。随后以冻干细胞为催化剂，在5 L反应体系中加入32 g/L细胞和10 g/L底物（含XDT 62.12%），平均转化率约81%，总产物浓度达6.17 g/L，其中目标产物DT为4.23 g/L。经乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析和制备型HPLC纯化，三种产物DT、DC、DTC的平均回收率约70%。研究证实了高细胞密度发酵结合低溶氧策略可显著提升重组酶产量，所建立的5 L级生物转化与纯化流程为利用丰富紫杉资源半合成紫杉醇提供了可行的工业化基础。
创新点
首次实现LXYL-P1-2重组酶的高细胞密度发酵，通过优化初始细胞密度（300 g/L）和低溶氧（5%）策略使生物量酶活达到6.55×10^4 U/g；在5 L反应体系中实现了高底物浓度（10 g/L）的高效生物转化（转化率约81%）；建立了从底物到三种产物的完整纯化工艺，平均回收率约70%。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 7-β-木糖基紫杉烷水解（紫杉醇半合成前体转化） | Lxyl-p1-2 | LXYL-P1-2 | 催化 | 重组菌株GS115-3.5K-P1-2，使用pPIC3.5K载体胞内表达，高细胞密度发酵后冻干细胞用于生物转化 |
关键发现
- 在优化条件下（初始细胞密度300 g/L，DO 5%），重组毕赤酵母发酵获得最大生物量312.3 g/L（湿重），生物量酶活达6.55×10^4 U/g，体积酶活2.05×10^7 U/L。5 L生物转化反应中，冻干细胞32 g/L，底物10 g/L（含XDT
- 12%、XDC
- 75%、XDTC
- 04%），平均转化率约81%（XDT
- 4%、XDC
- 4%、XDTC
- 4%），总产物浓度6.17 g/L（DT
- 23 g/L、DC
- 87 g/L、DTC
- 07 g/L）。经纯化得到DT
- 13 g、DC
- 04 g、DTC
- 47 g，回收率分别为71.5%、71.2%、68.4%，平均约70%。对照反应（200 mL）转化率约85%，总产量6.05 g/L。
研究结论
该研究通过高细胞密度发酵和5 L规模生物转化，实现了重组LXYL-P1-2酶对7-β-木糖基紫杉烷的高效水解，并建立了产物纯化流程，为利用丰富紫杉资源半合成紫杉醇提供了工业化基础。