Metabolic engineering of Escherichia coli to produce zeaxanthin
- 作者
- Xi-Ran Li, Gui-Qiao Tian, Hong-Jie Shen, Jian-Zhong Liu
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s10295-014-1565-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在大肠杆菌中异源合成玉米黄质产量较低，需要优化从番茄红素到玉米黄质的生物合成途径，实现高产。
研究策略
利用融合蛋白介导的底物通道效应以及可调基因间区（TIGRs）文库来协调番茄红素β-环化酶基因crtY和β-胡萝卜素3-羟化酶基因crtZ的表达，并筛选最优的crtZ来源。
核心内容
本研究在大肠杆菌中系统优化了玉米黄质异源合成途径。初始菌株仅积累β-胡萝卜素而不产生玉米黄质，通过引入CrtY-L-CrtZ融合蛋白实现底物通道效应，产量达到1.54 mg/g DCW；进一步采用可调基因间区（TIGR）文库协调crtY与crtZ的表达，产量提升至1.84 mg/g DCW，且转录分析显示TIGR使crtZ转录水平较对照提高约476倍，验证了CrtZ催化的羟基化反应为限速步骤。随后筛选不同来源的crtZ基因，发现Pantoea ananatis来源的CrtZ活性最优，最终构建的携带双拷贝P37启动子驱动crtZ的菌株产生玉米黄质11.95±0.21 mg/g DCW（43.46±0.57 mg/L），为文献报道的已工程化大肠杆菌最高产量的7.5倍。该工作证明TIGR策略优于蛋白融合，并通过靶向限速酶过表达实现了大肠杆菌中玉米黄质的高产积累，为类胡萝卜素途径的代谢工程优化提供了有效范例。
创新点
（1）系统比较了蛋白融合与TIGR两种底物通道策略，发现TIGR更高效；（2）通过转录和酶活分析证明CrtZ催化的反应是玉米黄质合成中的限速步骤；（3）通过过表达Pantoea ananatis来源的crtZ，获得目前文献报道的最高大肠杆菌玉米黄质产量。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli LYCOP | 玉米黄质生物合成途径 | crtY | 番茄红素β-环化酶 (CrtY) | 催化 | 来自Pantoea ananatis，催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli LYCOP | 玉米黄质生物合成途径 | crtZ | β-胡萝卜素3-羟化酶 (CrtZ) | 催化 | 来自Pantoea ananatis，催化β-胡萝卜素C-3位羟基化生成玉米黄质，是限速步骤 |
| Escherichia coli LYCOP | 玉米黄质生物合成途径 | crtY-L-crtZ (融合基因) | CrtY-(G4S)3-CrtZ融合蛋白 | 催化 | 通过(G4S)3连接肽融合CrtY和CrtZ，实现底物通道，产量1.54 mg/g DCW |
| Escherichia coli LYCOP | 玉米黄质生物合成途径 | — | — | 调控 | 可调基因间区TIGR11插入crtY和crtZ之间，协调二者表达，产量1.84 mg/g DCW |
| Escherichia coli BETA-1 | 玉米黄质生物合成途径 | crtY | 番茄红素β-环化酶 (CrtY) | 催化 | crtY被整合到染色体并受P37启动子控制，使番茄红素完全转化为β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli BETA-1 | 玉米黄质生物合成途径 | crtZ (P. ananatis) | β-胡萝卜素3-羟化酶 (CrtZ) | 催化 | 双拷贝P37启动子驱动表达，产量11.95±0.21 mg/g DCW |
| Escherichia coli BETA-1 | 玉米黄质生物合成途径 | crtZ (P. agglomerans) | β-胡萝卜素3-羟化酶 (CrtZ) | 催化 | 与P. ananatis crtZ比较，产量仅4.40±0.28 mg/g DCW |
| Escherichia coli BETA-1 | 玉米黄质生物合成途径 | crtZ (H. pluvialis) | β-胡萝卜素3-羟化酶 (CrtZ) | 催化 | 与P. ananatis crtZ比较，产量仅2.72±1.09 mg/g DCW |
关键发现
- 初始E. coli LYCOP(pQE-crtYZ)不产生玉米黄质，仅积累β-胡萝卜素
- 融合蛋白CrtY-L-CrtZ使玉米黄质产量达1.54 mg/g DCW
- TIGR11介导的共表达提高至1.84 mg/g DCW
- 额外表达pBAD-crtZ后进一步提高至2.72 mg/g DCW。转录分析显示TIGR使crtZ转录水平较对照提高约476倍，CrtZ活性达6.21 pg/h/mg蛋白。最终菌株E. coli BETA-1[pZSAPB-2(P37-crtZPAN)]（携带两个P37启动子驱动的P. ananatis crtZ拷贝）产生玉米黄质11.95±0.21 mg/g DCW（43.46±0.57 mg/L），为文献报道的已工程化大肠杆菌的7.5倍。
研究结论
通过TIGR协调crtY和crtZ表达并筛选来源，确认CrtZ为限速酶，利用Pantoea ananatis crtZ过表达可实现大肠杆菌玉米黄质的高产，达到11.95 mg/g DCW，为迄今报道的最高水平。