Engineering the leucine biosynthetic pathway for isoamyl alcohol overproduction in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Jifeng Yuan, Pranjul Mishra, Chi Bun Ching
- 单位
- 新加坡国立大学化学与生物分子工程系；新加坡国立大学淡马锡实验室；新加坡理工大学；新加坡科技研究局生物转化创新平台
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1007/s10295-016-1855-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
酿酒酵母天然异戊醇合成途径存在线粒体与胞质之间的区室化，导致底物转运限制和产量低下；同时Ehrlich途径酶的底物宽泛性导致副产物异丁醇大量生成。
研究策略
通过去除线粒体靶向信号，将α-异丙基苹果酸（α-IPM）合成途径重新定位至胞质，构建胞质正交途径；过表达Ehrlich降解途径基因ARO10/ADH7；并利用融合蛋白（ILV3c-LEU9c或LEU9c-ILV3c）作为人工蛋白支架，将二羟酸脱水酶和α-IPM合酶共定位，以引导代谢流向异戊醇合成。
核心内容
针对酿酒酵母天然异戊醇合成受限于线粒体与胞质区室化、底物转运受限及Ehrlich途径副产物竞争等问题，该研究将α-异丙基苹果酸（α-IPM）合成途径相关酶去除线粒体靶向信号后重定位至胞质，构建了正交的胞质异戊醇合成途径，并过表达ARO10和ADH7以强化Ehrlich降解。同时，设计了基于酶四级结构的融合蛋白ILV3c-LEU9c或LEU9c-ILV3c作为人工支架，实现二羟酸脱水酶与α-IPM合酶的共定位以引导代谢流。结果显示，胞质途径菌株中最佳CC6a产异戊醇275.83 mg/L，而引入ILV3c-LEU9c支架后多数菌株异戊醇产量提高两倍以上，最佳CC1b达472.24 mg/L；LEU9c-ILV3c支架的最佳菌株CC3c产异戊醇522.76 mg/L，对照菌株支链醇产量低于20 mg/L。该工作通过胞质重定位与蛋白支架策略绕开天然区室化限制，显著提升异戊醇产量，且该酶共定位方法可推广至其他级联反应以提高催化效率。
创新点
首次在酿酒酵母中绕开天然区室化的α-IPM合成途径；提出基于酶四级结构的融合蛋白作为人工支架，实现酶共定位而不破坏酶活性，显著提高异戊醇产量。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 支链氨基酸/异戊醇合成途径 | ILV2 | 乙酰乳酸合酶 | 催化 | 去除线粒体靶向信号后胞质表达（ILV2c） |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 支链氨基酸/异戊醇合成途径 | ILV5 | 酮醇酸还原异构酶 | 催化 | 去除线粒体靶向信号后胞质表达（ILV5c） |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 支链氨基酸/异戊醇合成途径 | ILV3 | 二羟酸脱水酶 | 催化 | 去除线粒体靶向信号后胞质表达（ILV3c），参与蛋白支架 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 亮氨酸生物合成途径 | LEU9 | α-异丙基苹果酸合酶（抗反馈抑制型） | 催化 | 去除线粒体靶向信号后胞质表达（LEU9c），参与蛋白支架 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 亮氨酸生物合成途径 | LEU1 | 异丙基苹果酸异构酶 | 催化 | 胞质表达 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 亮氨酸生物合成途径 | LEU2 | β-异丙基苹果酸脱氢酶 | 催化 | 胞质表达 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | Ehrlich降解途径 | ARO10 | α-酮酸脱羧酶 | 催化 | 过表达，催化KIC/KIV等脱羧 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | Ehrlich降解途径 | ADH7 | 醇脱氢酶 | 催化 | 过表达，催化醛还原为醇 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 支链氨基酸转氨 | BAT1/BAT2 | 支链氨基酸转氨酶 | 催化 | 线粒体/胞质同工酶，参与天然途径 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 丙酮酸转运 | MPC1-2/3 | 线粒体丙酮酸载体 | 转运 | 天然途径中丙酮酸向线粒体转运 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | α-IPM转运 | OAC1 | α-异丙基苹果酸转运蛋白 | 转运 | 天然途径中α-IPM从线粒体转运至胞质 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 亮氨酸生物合成途径 | ILV3c-LEU9c / LEU9c-ILV3c | 人工蛋白支架（融合蛋白） | 调控 | 基于酶四级结构，共定位ILV3c和LEU9c，促进底物通道 |
关键发现
- 构建胞质途径的菌株CC1~CC6a产异丁醇400~750 mg/L、异戊醇200~300 mg/L，其中最佳CC6a产异戊醇275.83±12.12 mg/L、异丁醇743.38±32.02 mg/L、2-甲基-1-丁醇88.20±4.86 mg/L
- 引入支架ILV3c-LEU9c后多数菌株异戊醇提高两倍以上，最佳CC1b产472.24±40.82 mg/L
- 引入支架LEU9c-ILV3c后最佳CC3c产异戊醇522.76±38.88 mg/L、异丁醇540.30±48.26 mg/L、2-甲基-1-丁醇82.56±8.22 mg/L
- 对照菌株BY4741仅产<20 mg/L支链醇。
研究结论
通过胞质重定位和人工蛋白支架策略，成功实现了异戊醇的高产，绕过了天然区室化限制；该蛋白支架方法可推广应用于其他级联酶促反应，提高催化效率和产物特异性。