Genetic Modification of the Soybean to Enhance the β-Carotene Content through Seed-Specific Expression
- 作者
- Mi-Jin Kim, Jae Kwang Kim, Hye Jeong Kim, Jung Hun Pak, Jai-Heon Lee, Doh-Hoon Kim, Hong Kyu Choi, Ho Won Jung, Jeong-Dong Lee, Young-Soo Chung, Sun-Hwa Ha
- 单位
- Department of Genetic Engineering, Dong-A University, Busan, Republic of Korea; National Academy of Agricultural Science, Rural Development Administration, Suwon, Republic of Korea; School of Applied Biosciences, Kyungpook National University, Daegu, Republic of Korea
- 杂志
- PLoS ONE（2012）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0048287
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高大豆种子中β-胡萝卜素（维生素A前体）含量，以缓解维生素A缺乏症。
研究策略
利用农杆菌介导的半粒种子转化法，将重组PAC基因（来自辣椒的八氢番茄红素合酶Psy和来自泛菌的胡萝卜素脱饱和酶CrtI，通过2A序列连接）置于种子特异性β-伴大豆球蛋白启动子或组成型CaMV-35S启动子下，转入韩国大豆品种Kwang'an，实现种子特异性过量表达。
核心内容
本研究通过农杆菌介导的半粒种子转化法，将来自辣椒的八氢番茄红素合酶基因Psy和来自泛菌的胡萝卜素脱饱和酶基因CrtI以2A序列连接成双顺反子PAC基因，分别置于种子特异性β-伴大豆球蛋白启动子和组成型CaMV-35S启动子下，转入韩国大豆品种Kwang'an，以提升种子中β-胡萝卜素含量。共获得37个转基因大豆系，转化效率约5%。结果表明，种子特异性表达β-PAC的种子总类胡萝卜素最高达146 μg/g，约为非转基因的62倍，其中β-胡萝卜素占77%（112 μg/g）；T2代平均总类胡萝卜素为110.7 μg/g，是35S-PAC（2.5 μg/g）和非转基因（2.4 μg/g）的约45倍，β-胡萝卜素和α-胡萝卜素分别较组成型表达增加28倍和25倍。35S-PAC种子类胡萝卜素含量与对照无显著差异，而叶片类胡萝卜素水平在各系间差异不大，表明种子特异性启动子的靶向积累策略优于组成型表达。β-PAC种子还表现出更高的抗氧化活性和轻微提升的生育酚及植物甾醇含量。该高β-胡萝卜素大豆可作为生物强化食品，为缓解维生素A缺乏提供潜在途径。
创新点
首次在韩国大豆中利用双顺反子PAC基因结合种子特异性启动子实现高β-胡萝卜素积累；采用改良半粒种子转化法提高效率至约5%；证明了种子特异性表达比组成型表达更有助于类胡萝卜素积累。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Glycine max (L.) cv. Kwangan | 类胡萝卜素生物合成 | Psy | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自辣椒（Capsicum），作为重组PAC基因的一部分 |
| Glycine max (L.) cv. Kwangan | 类胡萝卜素生物合成 | CrtI | 胡萝卜素脱饱和酶 | 催化 | 来自泛菌（Pantoea），作为重组PAC基因的一部分 |
| Glycine max (L.) cv. Kwangan | 类胡萝卜素生物合成 | PAC (Psy-2A-CrtI) | 双顺反子多肽 | 催化 | 重组基因，利用2A序列同时表达Psy和CrtI |
| Glycine max (L.) cv. Kwangan | 类胡萝卜素生物合成 | β-伴大豆球蛋白启动子 | — | 调控 | 驱动PAC基因种子特异性表达 |
| Glycine max (L.) cv. Kwangan | 类胡萝卜素生物合成 | CaMV-35S启动子 | — | 调控 | 驱动PAC基因组成型表达 |
| Agrobacterium tumefaciens EHA105 | 植物转化 | Bar | 草丁膦乙酰转移酶 | 催化 | 作为选择标记基因，赋予DL-phosphinothricin抗性 |
关键发现
- 共获得37个转基因大豆系（19个β-PAC，18个35S-PAC），转化效率约5%
- β-PAC种子总类胡萝卜素最高达146 μg/g（约62倍于非转基因），其中β-胡萝卜素112 μg/g（占77%）
- T2代β-PAC种子平均总类胡萝卜素为110.7 μg/g，是35S-PAC（2.5 μg/g）、非转基因（2.4 μg/g）和空载体（1.6 μg/g）的约45倍
- β-胡萝卜素和α-胡萝卜素分别比35S-PAC种子增加28倍和25倍
- β-PAC种子中β/α类胡萝卜素比平均为3.6，而35S-PAC和非转基因均为0.03
- 35S-PAC种子类胡萝卜素含量与对照无显著差异
- 叶片类胡萝卜素总水平和β/α比值在不同系间差异不大（β-PAC平均1008 μg/g，35S-PAC 875 μg/g，非转基因882 μg/g）
- β-PAC种子中β-胡萝卜素含量比此前转基因水稻高175倍，总类胡萝卜素是Golden Rice 2的4倍
- 35S-PAC种子总生育酚增加1.5倍，其中α-生育酚增加约3倍
- β-PAC种子总植物甾醇增加1.3倍，主要来自β-谷甾醇
- DPPH自由基清除实验中，β-PAC种子EC50值（40.21-59.41 mg/10mL）显著低于非转基因（68.64 mg/10mL）和空载体（75.25 mg/10mL），显示更高抗氧化活性。
研究结论
通过种子特异性启动子驱动重组PAC基因在大豆种子中过量表达，成功将总类胡萝卜素和β-胡萝卜素含量大幅提高，且不影响叶片类胡萝卜素水平。该高β-胡萝卜素大豆可作为富含维生素A和抗氧化剂的生物强化食品，有望为人类和牲畜提供健康益处。