Regulation of crucial enzymes and transcription factors on 2-phenylethanol biosynthesis via Ehrlich pathway in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Zhaoyue Wang, Xuejing Bai, Xuena Guo, Xiuping He
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s10295-016-1852-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母中2-苯乙醇（2-PE）产量低，且Ehrlich途径的代谢调控机制尚不明确，尤其是氮代谢物阻遏（NCR）对关键酶的影响及其调控因子未知。
研究策略
通过组成型启动子过表达Ehrlich途径关键基因ARO8、ARO10和转录因子ARO80，比较不同氮源培养基下的产量和酶活；进一步过表达CAT8、敲除MIG1及构建组合菌株，分析其对ARO9/ARO10转录、细胞生长和2-PE合成的影响。
核心内容
该研究系统探究了酿酒酵母Ehrlich途径合成2-苯乙醇（2-PE）的关键酶与转录因子调控机制。作者通过组成型启动子过表达ARO8、ARO10和ARO80，并进一步构建CAT8过表达、MIG1敲除及组合菌株，在不同氮源条件下比较产量、酶活和转录水平。结果显示，过表达ARO8或ARO10使2-PE产量提高约42%至3.2 g/L，而CAT8过表达菌株产量达3.73 g/L，转化率91.7%。研究发现转氨酶Aro8是氮代谢物阻遏（NCR）的关键靶点，在含硫酸铵培养基中酶活不足苯丙氨酸培养基的一半，但mRNA水平相近，表明存在翻译后水平的抑制。CAT8过表达使ARO9和ARO10转录分别提高10倍和8倍，MIG1敲除亦显著上调这两个基因，组合菌株中CAT8表达提高22倍，单位细胞产量达1.241 g/g干燥细胞为最高。该工作揭示了Cat8和Mig1对2-PE合成的新调控作用，为解除NCR抑制、提升芳香族化合物产量提供了新策略。
创新点
揭示转氨酶Aro8是Ehrlich途径中氮代谢物阻遏的关键靶点；首次报道转录因子Cat8和Mig1对2-PE生物合成的调控作用；构建CAT8过表达与MIG1敲除联合菌株，实现最高单位细胞产量。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | Ehrlich pathway | ARO8 | Aro8 | 催化 | 芳香族氨基转移酶I，催化L-苯丙氨酸转氨为苯丙酮酸，是氮代谢物阻遏的关键靶点 |
| Saccharomyces cerevisiae | Ehrlich pathway | ARO9 | Aro9 | 催化 | 芳香族氨基转移酶II，其转录受Cat8和Mig1调控 |
| Saccharomyces cerevisiae | Ehrlich pathway | ARO10 | Aro10 | 催化 | 苯丙酮酸脱羧酶，催化苯丙酮酸脱羧为苯乙醛 |
| Saccharomyces cerevisiae | Ehrlich pathway | ARO80 | Aro80 | 调控 | Zn2Cys6家族转录激活因子，激活ARO9和ARO10转录 |
| Saccharomyces cerevisiae | Ehrlich pathway | CAT8 | Cat8 | 调控 | 锌簇转录因子，过表达上调ARO9和ARO10转录 |
| Saccharomyces cerevisiae | Ehrlich pathway | MIG1 | Mig1 | 调控 | Cys2His2锌指转录抑制因子，敲除可解除对CAT8的抑制 |
关键发现
- 过表达ARO8或ARO10使2-PE产量较对照提高约42%，达约3.2 g/L
- CAT8过表达菌株产量提高62%，达3.73 g/L，转化率91.7%
- MIG1敲除菌株产量3.05 g/L
- CAT8过表达+MIG1敲除菌株产量3.58 g/L，单位细胞产量1.241 g/g干燥细胞为最高
- 在SC+Phe培养基中，ARO8过表达菌株的转氨酶活性不足Phe培养基中的一半（如24h为0.38 vs 0.78 IU/mg），但mRNA水平相近，表明Aro8活性受硫酸铵抑制
- ARO8、ARO10、ARO80过表达菌株的mRNA分别比对照高13.2-14.4倍、10.3-11.1倍、13.5倍
- CAT8过表达使ARO9和ARO10转录分别提高10倍和8倍，MIG1敲除使CAT8转录提高10倍、ARO9和ARO10分别提高10.5倍和8.3倍，组合菌株中CAT8提高22倍、ARO9和ARO10分别提高12倍和10倍。
研究结论
高效表达芳香族氨基转移酶和苯丙酮酸脱羧酶可显著提高2-PE合成；氮源对Aro8和Aro10的影响不同，转氨酶是NCR的关键靶点；Cat8过表达和Mig1敲除通过上调ARO9/ARO10转录促进2-PE合成；综合性能最优的工程菌株为YS58(CAT8)，具有工业应用潜力。