Expression of Escherichia coli AppA2 phytase in four yeast systems
- 作者
- Seonho Lee, Taewan Kim, Chad H. Stahl, Xin Gen Lei
- 单位
- Department of Animal Science, Cornell University, Ithaca, NY, 14853-4801, USA
- 杂志
- Biotechnology Letters（2005）
- DOI
- 10.1007/s10529-005-0704-6
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
开发高效发酵系统生产大肠杆菌植酸酶AppA2，并比较四种酵母表达系统（酿酒酵母、裂殖酵母、毕赤酵母诱导型和组成型）的表达效率与酶学特性
研究策略
将大肠杆菌appA2基因克隆到四种酵母表达载体（pYES2、pDS472a、pPICZαA、pGAPZαA）中，分别在酿酒酵母、裂殖酵母和毕赤酵母中表达，通过摇瓶发酵比较产酶活性、生化特性及水解天然植酸的能力
研究路线图
核心内容
将大肠杆菌植酸酶基因appA2分别克隆至四种酵母表达载体，在酿酒酵母、裂殖酵母以及毕赤酵母的诱导型和组成型系统中进行胞外分泌表达。摇瓶发酵八天后，诱导型毕赤酵母产酶活性最高，达272 U/ml培养基（约0.63 mg植酸酶/ml），而裂殖酵母产量最低，仅2.8 U/ml（0.006 mg/ml）。尽管产量差异悬殊，裂殖酵母所产AppA2对植酸钠的Km值仅为0.3 mM，比其他系统低60%至75%，且65°C处理10分钟后残留活性高出约28%，显示出更强的底物亲和力与热稳定性。四种酶的最适pH均为3.5，最适温度均为55°C，去糖基化后分子量一致，水解大豆粕植酸磷释放的磷酸盐量也无显著差异。结果表明，毕赤酵母诱导型系统在产量上占优，而裂殖酵母表达产物在酶学特性上更具优势，实际生产中可按对产量或酶性质的需求灵活选择宿主。
创新点
首次实现大肠杆菌AppA2植酸酶在酿酒酵母和裂殖酵母中的功能性胞外分泌表达；比较了毕赤酵母组成型与诱导型表达系统；发现裂殖酵母表达的AppA2具有更低的Km（更强底物亲和力）和更高的65°C热稳定性
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae INVSc1 | 植酸降解（磷释放） | appA2 | AppA2 phytase | 催化 | 使用pYES2质粒和α因子信号肽分泌表达，8天摇瓶发酵活性为6.7 U/ml（0.015 mg/ml） |
| Schizosaccharomyces pombe ATCC 38436 | 植酸降解（磷释放） | appA2 | AppA2 phytase | 催化 | 使用pDS472a质粒和α因子信号肽分泌表达，活性最低2.8 U/ml（0.006 mg/ml）；pH 3.5时Km为0.3 mM，比其他系统低60-75%；65°C热稳定性高28% |
| Pichia pastoris X33 | 植酸降解（磷释放） | appA2 | AppA2 phytase | 催化 | 使用pGAPZαA组成型表达载体，活性92 U/ml（0.21 mg/ml），培养基为YPD |
| Pichia pastoris X33 | 植酸降解（磷释放） | appA2 | AppA2 phytase | 催化 | 使用pPICZαA甲醇诱导型表达载体，活性最高272 U/ml（0.63 mg/ml） |
| Saccharomyces cerevisiae INVSc1 | 蛋白质分泌途径 | α-factor信号肽编码序列 | α-factor信号肽 | 转运 | 从pGAPZαA中扩增的α因子信号肽用于引导AppA2在酿酒酵母和裂殖酵母中的胞外分泌 |
关键发现
- 四种系统均产生胞外功能性AppA2植酸酶，表观分子量51.5-56 kDa
- 8天摇瓶发酵中，诱导型毕赤酵母（pPICZαA）产酶活性最高达272 U/ml培养基（相当于0.63 mg植酸酶/ml），裂殖酵母（pDS472a）最低为2.8 U/ml（0.006 mg/ml）
- 组成型毕赤酵母（pGAPZαA）和酿酒酵母（pYES2）分别为92 U/ml（0.21 mg/ml）和6.7 U/ml（0.015 mg/ml）
- 裂殖酵母表达的AppA2在pH 3.5时对植酸钠的Km为0.3 mM，比其他系统的1.2、0.8、0.7 mM低60-75%
- 65°C处理10 min后其残留活性比其他系统高28%
- 四种酶的pH最适值均为3.5，温度最适值均为55°C
- 去糖基化后均呈单一46.3 kDa条带
- 水解大豆粕植酸磷时释放磷酸盐量分别为18.4±0.7、16.9±0.8、16.6±0.4、17.2±0.5 μmol/g大豆粕，差异不显著
研究结论
诱导型毕赤酵母系统（pPICZαA）是四者中产酶最高的系统；裂殖酵母表达的AppA2具有更强的底物亲和力和更高的热稳定性，但四种系统产生的酶在pH和温度最适性质及水解天然植酸底物效果上基本一致，可根据工业需求灵活选择表达系统