Expression of bacterial hemoglobin in the yeast, Pichia pastoris, with a low O2-induced promoter
- 作者
- Liang-Jung Chien, Cheng-Kang Lee
- 单位
- Department of Chemical Engineering, National Taiwan University of Science and Technology, 106 Taipei, Taiwan
- 杂志
- Biotechnology Letters（2005）
- DOI
- 10.1007/s10529-005-1324-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在毕赤酵母中实现无需外加诱导剂的低氧调控型异源蛋白表达，并利用细菌血红蛋白改善微氧条件下的细胞生长。
研究策略
利用来自Pichia stipitis的低氧诱导型ADH2启动子（PsADH2）驱动Vitreoscilla血红蛋白基因（vgb）在Pichia pastoris X33中表达，构建整合型载体pLJ02，通过CO差光谱、Western blot和Northern blot验证表达，并比较VHb+与VHb-菌株在微氧条件下的生长。
研究路线图
核心内容
该研究利用来自树干毕赤酵母的低氧诱导型ADH2启动子（PsADH2）驱动透明颤菌血红蛋白基因（vgb）在毕赤酵母X33中表达，构建了整合型载体pLJ02。通过CO差光谱、Western blot和Northern blot确证了VHb的功能性表达，并比较了微氧条件下VHb阳性与阴性菌株的生长差异。结果显示，在低氧条件（<5%空气饱和度）下VHb表达量达16.13 nmol/g DCW，约为60%空气饱和度下的24倍；微氧培养时，VHb阳性菌株的细胞密度比阴性菌株高出约3 g DCW/l。VHb mRNA约442 bp，蛋白条带约16 kDa，均与预期相符。研究表明PsADH2启动子在毕赤酵母中同样受低氧诱导，且无需甲醇等外加诱导物，仅通过溶氧调控即可实现高效表达，VHb的表达显著改善了微氧条件下的细胞生长。该系统为高密度培养中无诱导剂的高水平异源蛋白生产提供了可行方案。
创新点
首次在P. pastoris中使用PsADH2低氧诱导启动子表达异源蛋白；该启动子无需添加甲醇或其它诱导物，仅通过溶氧调控即可实现高水平表达。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris X33 | 异源蛋白表达（VHb表达） | vgb | Vitreoscilla hemoglobin (VHb) | 能量供给 | 低氧条件下VHb表达量16.13 nmol/g DCW，比高氧条件高约24倍，增强微氧条件下的细胞生长 |
| Pichia pastoris X33 | 基因表达调控 | PsADH2 promoter | — | 调控 | 来自Pichia stipitis的ADH2启动子，在P. pastoris中受低氧诱导 |
| Pichia stipitis CBS 6054 | 乙醇发酵 | ADH2 | 酒精脱氢酶II (ADH II) | 催化 | ADH2启动子被克隆用于调控vgb基因表达 |
关键发现
- 在低氧（<5%空气饱和度）条件下，VHb表达量为16.13 nmol/g DCW，约是60%空气饱和度下的0.67 nmol/g DCW的24倍
- 微氧培养时，VHb+菌株细胞密度比VHb-菌株高约3 g DCW/l
- VHb mRNA大小约442 bp，接近预期456 bp
- SDS-PAGE和Western blot显示约16 kDa的VHb蛋白条带。
研究结论
PsADH2启动子在P. pastoris中同样受到低氧诱导，并能驱动VHb功能性表达；VHb的表达增强了微氧条件下的细胞生长。该系统可望用于高密度培养中无诱导剂的高水平异源蛋白生产。