Cloning and characterization of the bifunctional alcohol/acetaldehyde dehydrogenase gene (adhE) in Leuconostoc mesenteroides isolated from kimchi
- 作者
- Ok Kyung Koo, Do-Won Jeong, Jung Min Lee, Min Jung Kim, Jong-Hoon Lee, Hae Choon Chang, Jeong Hwan Kim, Hyong Joo Lee
- 单位
- School of Agricultural Biotechnology, and Center for Agricultural Biomaterials, Seoul National University; Department of Food Science and Biotechnology, Kyonggi University; Department of Food and Nutrition, Chosun University; Division of Applied Life Science, Graduate School, Gyeongsang National University
- 杂志
- Biotechnology Letters（2005）
- DOI
- 10.1007/s10529-005-2541-z
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
从泡菜中分离的肠膜明串珠菌C7中克隆并表征双功能醇/乙醛脱氢酶基因adhE，以阐明异型发酵中乙醇生成的酶学基础。
研究策略
通过PCR从LMC7基因组中扩增adhE基因，克隆至pGEM-T载体构建pADHE，转化不同E. coli宿主（BL21、DH5α、JM109）进行异源表达，结合SDS-PAGE和酶活测定表征AdhE的功能。
研究路线图
核心内容
该研究首次从泡菜来源的肠膜明串珠菌C7中克隆并功能表征了双功能醇/乙醛脱氢酶基因adhE。通过PCR扩增获得全长2685 bp的adhE基因，编码886个氨基酸、预测分子量约96.6 kDa的AdhE蛋白，与肠膜明串珠菌crenoris亚种的AdhE氨基酸同源性高达99%。将adhE克隆至pGEM-T载体并转化不同大肠杆菌宿主进行异源表达，SDS-PAGE及酶活测定证实其同时具有醇脱氢酶和乙醛脱氢酶活性。在BL21中表达后，醇脱氢酶活性为7.5 U/mg，乙醛脱氢酶活性为1.7 U/mg，整体AdhE活性达7.8 U/mg；DH5α中相应活性分别为5.7和1.6 U/mg。AdhE催化顺序反应将乙酰-CoA依次转化为乙醛和乙醇，且醇脱氢酶产生NADH的量较乙醛脱氢酶多约4倍，使NAD+再生增加1.2%。研究为阐明异型发酵中乙醇生成的酶学基础及优化相关发酵工艺提供了重要依据。
创新点
首次在Leuconostoc属中克隆并功能表征adhE基因，证实其编码双功能AdhE酶，具有醇脱氢酶和乙醛脱氢酶两种活性。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Leuconostoc mesenteroides C7 | 异型发酵（乙醇合成） | adhE | AdhE（双功能醇/乙醛脱氢酶） | 催化 | 基因供体菌株，分离自泡菜 |
| Escherichia coli BL21 | 异源表达 | adhE | AdhE（双功能醇/乙醛脱氢酶） | 催化 | 表达宿主，携带pADHE质粒 |
关键发现
- adhE基因全长2685 bp，编码886个氨基酸，预测分子量约96.6 kDa
- 与Leuconostoc mesenteroides sp. crenoris的AdhE氨基酸同源性高达99%
- 在E. coli BL21中表达后，醇脱氢酶活性为7.5 U/mg，乙醛脱氢酶活性为1.7 U/mg，AdhE整体活性为7.8 U/mg
- 在DH5α中Adh活性为5.7 U/mg，Aldh活性为1.6 U/mg
- BL21中Adh比Aldh产生NADH多4.3倍，DH5α中多3.6倍
- AdhE催化顺序反应使NAD+生成增加1.2%。
研究结论
克隆的LMC7 adhE编码双功能酶AdhE，可顺序催化乙酰-CoA转化为乙醛和乙醇。本研究首次在肠膜明串珠菌中克隆并分析adhE基因功能，为理解异型发酵中乙醇生成机制和改善发酵工艺提供了基础。