Mutations in Escherichia coli aceE and ribB Genes Allow Survival of Strains Defective in the First Step of the Isoprenoid Biosynthesis Pathway
- 作者
- Jordi Perez-Gil, Eva Maria Uros, Susanna Sauret-Gueto, L. Maria Lois, James Kirby, Minobu Nishimoto, Edward E. K. Baidoo, Jay D. Keasling, Albert Boronat, Manuel Rodriguez-Concepcion
- 单位
- Centre for Research in Agricultural Genomics (CRAG) CSIC-IRTA-UAB-UB, Campus UAB Bellaterra, Barcelona, Spain; Joint BioEnergy Institute, Emeryville, California, United States of America; Department de Bioquímica i Biologia Molecular, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain
- 杂志
- PLoS ONE（2012）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0043775
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析大肠杆菌中MEP途径第一步（DXS催化）被阻断后，细菌通过自发突变存活并绕过DXS缺陷的遗传机制，并评估DXS作为抗生素靶点的可行性。
研究策略
利用携带MVA操纵子且dxs缺失的大肠杆菌菌株（EcAB4-2），在无MVA培养基上筛选自发和EMS诱导的抑制子突变体；通过基因组文库互补和测序鉴定突变基因；构建突变体基因进行功能互补实验；利用DXS/DXR双缺陷菌株结合LC-MS检测体内DXP水平，验证突变酶是否产生DXP。
核心内容
该研究通过构建携带MVA操纵子且dxs缺失的大肠杆菌菌株，在无MVA培养基上筛选自发及EMS诱导的抑制子突变，以解析MEP途径第一步被阻断后的逃逸机制。对26个DXS缺陷抑制子的鉴定表明，22个携带aceE突变（以L633R为主，共17个），4个携带ribB突变（G108S和D113G各2个），均能恢复无MVA条件下的生长，而野生型基因无此功能。在DXS/DXR双缺陷菌株中表达突变aceE或ribB，DXP水平较对照提高约20倍，且互补实验显示突变基因无法挽救DXR缺陷菌株，说明突变酶产生的代谢物作用于DXR上游。自发抑制频率为6.4×10⁻⁹。结果表明，aceE和ribB的特定点突变可使丙酮酸脱氢酶E1亚基或DHBPS获得合成DXP或其前体的新活性，从而绕过DXS缺陷。此类突变易产生，意味着DXS并非理想的抗生素靶点，而突变型PDH和DHBPS在代谢工程中具有过表达DXP的应用潜力。
创新点
首次在DXS缺陷抑制子中鉴定出除aceE之外的ribB突变；证明aceE和ribB的特定点突变可使相应酶获得合成DXP（或其前体）的新功能，绕过MEP途径第一步；提出DXS并非理想的抗生素靶点。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | MEP途径（异戊二烯生物合成） | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS） | 催化 | MEP途径第一步酶，催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸缩合生成DXP；本研究中缺失 |
| Escherichia coli | MEP途径（异戊二烯生物合成） | dxr (ispC) | DXP还原异构酶（DXR） | 催化 | MEP途径第二步酶，催化DXP异构化还原为MEP；本研究中缺失用于验证突变产物作用于DXR上游 |
| Escherichia coli | 丙酮酸脱氢酶复合物途径 | aceE | 丙酮酸脱氢酶E1亚基（PDH） | 催化 | 编码PDH催化亚基；特定突变（Q408R、L633R、E636Q、E636G）获得合成DXP（或DX）的能力，绕过DXS功能 |
| Escherichia coli | 核黄素生物合成途径 | ribB | 3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合酶（DHBPS） | 催化 | 催化D-核酮糖-5-磷酸转化为甲酸和3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸；突变G108S和D113G使其产生可进入MEP途径的DXP（或前体） |
| Escherichia coli | MVA途径（外源补充） | MVA operon | 甲羟戊酸途径酶 | 催化 | 工程菌株携带合成MVA操纵子，使细胞能从外源MVA合成IPP/DMAPP，用于遗传筛选和互补实验 |
关键发现
- 在26个DXS缺陷抑制子中，22个携带aceE突变（Q408R 1个、L633R 17个、E636Q 3个、E636G 1个），4个携带ribB突变（G108S 2个、D113G 2个）
- 这些突变体均能在无MVA条件下恢复生长，而野生型aceE和ribB不能。DXS/DXR双缺陷菌株EcAB1-6中表达突变aceE或ribB基因，DXP水平较对照提高约20倍，而野生型基因无明显变化
- 无DXS的对照菌株仍可检测到痕量DXP。自发抑制频率为6.4×10^-9（DXS缺陷），DXR缺陷菌株为2.4×10^-9。互补实验证实突变基因不能挽救DXR缺陷菌株，表明突变酶产生的代谢物作用于DXR上游。
研究结论
大肠杆菌可通过aceE或ribB基因的特定点突变，使丙酮酸脱氢酶E1亚基或3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合酶获得产生DXP（或可转化为DXP的代谢物）的新活性，从而绕过MEP途径第一步DXS的缺失。由于此类突变易产生，DXS不适合作为抗生素开发靶点；突变型PDH和DHBPS可能用于代谢工程过表达DXP。