Production of artemisinin by genetically-modified microbes
- 作者
- Qingping Zeng, Frank Qiu, Ling Yuan
- 单位
- Laboratory of Biotechnology, Guangzhou University of Chinese Medicine; Simplex Biotechnologies, LLC; Department of Plant and Soil Sciences, The University of Kentucky
- 杂志
- Biotechnology Letters（2007）
- DOI
- 10.1007/s10529-007-9596-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
青蒿素在黄花蒿中含量极低，导致基于青蒿素的联合疗法（ACTs）供不应求，需要利用基因工程微生物大规模生产青蒿素前体（如amorpha-4,11-diene和artemisinic acid）以解决供应瓶颈。
研究策略
系统总结和评述了在酿酒酵母和大肠杆菌中异源表达青蒿素生物合成基因（如ADS、CYP71AV1等）以生产青蒿素前体（amorpha-4,11-diene和artemisinic acid）的代谢工程策略，包括优化前体供给、调控甾醇合成、共表达P450及其还原酶等。
研究路线图
核心内容
该文系统综述了通过代谢工程改造酿酒酵母和大肠杆菌生产青蒿素前体amorpha-4,11-diene与artemisinic acid的研究进展。在酿酒酵母中，单独表达ADS仅产生4.4 mg/l紫穗槐二烯，通过共表达截短HMGR、下调ERG9、过表达upc2-1及额外整合HMGR拷贝并过表达FPPS，产量逐步提升至153 mg/l，较初始水平提高近500倍；引入CYP71AV1及CPR后摇瓶产生约32 mg/l青蒿酸。在大肠杆菌中，构建外源MVA途径并共表达密码子优化的ADS，补料分批发酵产生280–480 mg/l紫穗槐二烯；对CYP71AV1进行密码子优化和N端修饰，并用黄花蒿CPR替换热带假丝酵母CPR使氧化产物提高12倍，使用pCWori质粒和DH1菌株后紫穗槐二烯氧化水平提升超过1000倍，达553 mg/l。化学转化青蒿酸至青蒿素的产率为30–40%。结果表明，微生物发酵结合化学半合成有望解决青蒿素供应瓶颈，但完整生物合成途径尚未重建，仍需阐明青蒿酸向青蒿素转化的生化机制。
创新点
综述了将黄花蒿青蒿素生物合成基因导入微生物的最新技术进展，包括多基因共表达、MVA通路重建、启动子调控、密码子优化、N端修饰等策略，并提出了从artemisinic acid化学半合成青蒿素的可行方案。
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | ADS | Amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 来自黄花蒿，异源表达催化FPP环化生成amorpha-4,11-diene |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 截短形式（tHMGR）增强FPP前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇生物合成 | ERG9 | 角鲨烯合酶 | 催化 | 用甲硫氨酸阻遏启动子下调其表达以减少甾醇竞争，增加FPP流向 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇调控 | upc2-1 | Upc2p转录因子 | 调控 | 突变的转录因子，上调甾醇合成相关基因以增加FPP |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素前体合成 | CYP71AV1 | Amorpha-4,11-diene oxidase | 催化 | 细胞色素P450单加氧酶，多步氧化amorpha-4,11-diene生成artemisinic acid |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素前体合成 | CPR | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | 为CYP71AV1提供电子，共表达促进氧化反应 |
| Saccharomyces cerevisiae | 倍半萜合成 | ECS | Epi-cedrol synthase | 催化 | 表达黄花蒿ECS产生epi-cedrol，用于对照研究 |
| Escherichia coli | MVA途径（外源） | MevT operon | 乙酰-CoA到甲羟戊酸相关酶 | 催化 | 构建外源MVA通路绕过内源DXP/MEP通路 |
| Escherichia coli | DXP/MEP途径 | DXS、DXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | 内源途径酶，非改造重点 |
| Escherichia coli | 青蒿素前体合成 | ADS | Amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 密码子优化以缓解FPP毒性并生产amorpha-4,11-diene |
| Escherichia coli | 青蒿素前体合成 | CYP71AV1 | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 密码子优化及N端跨膜域修饰，实现可溶性表达与活性 |
| Escherichia coli | 青蒿素前体合成 | CPR | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | 来自黄花蒿的aaCPRct比热带假丝酵母ctCPR更有效 |
| Escherichia coli | MVA途径 | HMGR | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 共表达防止HMG-CoA积累并提高甲羟戊酸产量 |
| Artemisia annua L. | 青蒿素生物合成途径 | ADS、CYP71AV1等 | 相关生物合成酶 | 催化 | 青蒿素基因的天然来源，低温胁迫诱导ADS和CYP71AV1上调10倍和7倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | ERG20 | 法呢基焦磷酸合酶 | 催化 | 过表达增加FPP，但会降低细胞密度，amorpha-4,11-diene产量再增约10% |
关键发现
- 在酿酒酵母中，质粒表达ADS产生约600 μg amorpha-4,11-diene/l，基因组整合仅约100 μg/l
- 单独表达ADS产生4.4 mg/l，共表达截短HMGR提高约5倍，下调ERG9增加2倍，下调ERG9并过表达upc2-1后达105 mg/l，再整合额外HMGR拷贝达149 mg/l，过表达FPPS后最终达153 mg/l（较报道水平提高近500倍）
- 引入CYP71AV1和CPR后摇瓶产生约32 mg artemisinic acid/l。酵母表达ECS产生epi-cedrol 90 μg/l，过表达upc2-1后达370 μg/l。在大肠杆菌中，构建外源MVA通路并共表达密码子优化的ADS，在补料分批反应器中产生280–480 mg amorpha-4,11-diene/l
- 密码子优化及N端修饰的CYP71AV1产生artemisinic alcohol 0.18–0.45 mg/l，用黄花蒿CPR替换热带假丝酵母CPR使产量提高12倍至5.6 mg/l，使用pCWori质粒和DH1菌株使amorpha-4,11-diene氧化提高超过1000倍至553 mg/l。化学转化artemisinic acid至artemisinin的产率为30–40%（w/w）。
研究结论
通过代谢工程改造微生物（酵母和大肠杆菌）能够高效生产青蒿素前体amorpha-4,11-diene和artemisinic acid，结合化学半合成可望实现青蒿素的规模化低成本生产，但完整生物合成途径尚未重建，仍需优化植物基因表达并阐明artemisinic acid向artemisinin转化的生化机制。