A screening system for inhibitors of trichothecene biosynthesis: hydroxylation of trichodiene as a target
- 作者
- Naoko Takahashi-Ando, Noriyuki Ochiai, Takeshi Tokai, Shuichi Ohsato, Takumi Nishiuchi, Minoru Yoshida, Makoto Fujimura, Makoto Kimura
- 单位
- Plant & Microbial Metabolic Engineering Research Unit, RIKEN DRI, Wako, Saitama 351-0198, Japan; Division of Life Science, Graduate School of Natural Science and Technology, Kanazawa University, Kanazawa, Ishikawa 920-1192, Japan; Chemical Genetics Laboratory, RIKEN DRI, Wako, Saitama 351-0198, Japan; Faculty of Life Sciences, Toyo University, Itakura, Gunma 374-0193, Japan
- 杂志
- Biotechnology Letters（2008）
- DOI
- 10.1007/s10529-008-9649-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
开发一种以 Tri4 为靶标的快速、高效筛选 trichothecene 生物合成抑制剂的方法，以应对真菌毒素污染问题。
研究策略
构建表达 Fusarium Tri4 的转基因酿酒酵母，以 trichodiene-11-one 为底物通过 HPLC 监测 2α-羟基化产物形成，评估黄酮类、呋喃香豆素类及含儿茶素饮料对 TRI4 活性的抑制，并在 Fusarium graminearum 中验证候选化合物对毒素产生的抑制。
研究路线图
核心内容
本研究建立了一个以 trichothecene 生物合成关键酶 Tri4（细胞色素 P450 单加氧酶）为靶标的抑制剂筛选系统。作者在酿酒酵母中异源表达禾谷镰刀菌 Tri4，以 trichodiene-11-one 为底物，通过 HPLC 监测 2α-羟基化产物生成来定量酶活性，系统评估了黄酮类、呋喃香豆素类及含儿茶素商业饮料的抑制作用。结果显示，未取代黄酮 flavone 是最强抑制剂，100 μM 时抑制 68% 的 2α-羟基化活性；黄烷酮在 50 和 100 μM 下分别抑制 34% 和 56%；甲氧基或羟基取代的黄酮类在 200 μM 时抑制率不足 20%；呋喃香豆素 bergapten 和 xanthotoxin 效果与 flavone 相当。在禾谷镰刀菌培养中，100 μM flavone 仅在第 3 天有效抑制毒素产生（对照毒素产量 27.2 μg/ml），而 200 μM 可在第 10 天仍显著降低 trichothecene 含量且不影响生物量；含儿茶素饮料在半浓度下显著抑制 TRI4 活性，但仅在早期有效。该筛选系统为快速鉴定 trichothecene 生物合成先导抑制剂提供了工具，并揭示了取代基类型对抑制活性的重要影响。
创新点
1) 首次建立以 Tri4 为靶标的酵母全细胞筛选系统；2) 利用 trichodiene-11-one 作底物便于 HPLC 检测；3) 系统评估多种黄酮/呋喃香豆素对 TRI4 的抑制作用；4) 发现含儿茶素的商业饮料在饮用浓度下可抑制 TRI4 活性。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (INVSc1) | trichothecene 生物合成（异源表达） | Tri4 | Tri4 (细胞色素 P450 单加氧酶) | 催化 | 转基因酵母表达密码子优化的 Tri4，作为全细胞催化剂催化 trichodiene-11-one 的 2α-羟基化 |
| Fusarium graminearum (MAFF 111233) | trichothecene 生物合成 | Tri4 | Tri4 (细胞色素 P450 单加氧酶) | 催化 | 用于验证候选化合物对 4,15-二乙酰基雪腐镰刀菌烯醇和 4-乙酰基雪腐镰刀菌烯醇产生的抑制作用 |
关键发现
- 未取代黄酮（flavone）是 TRI4 最强抑制剂，100 μM 时抑制 68% 的 2α-羟基化活性
- 黄烷酮在 50 和 100 μM 下分别抑制 34% 和 56%
- 甲氧基、羟基取代黄酮在 200 μM 时抑制率<20%
- 呋喃香豆素 bergapten 和 xanthotoxin 抑制效果与 flavone 相当，psoralen 略低。商业饮料 HG、HW、CS300 在半浓度下显著抑制 TRI4。在 Fusarium graminearum 培养中，100 μM flavone 仅早期（第3天）抑制毒素产生，>5天后无效
- 200 μM flavone 在第10天仍有效降低 trichothecene 含量而不显著影响生物量
- CS300 效果类似 100 μM flavone，仅早期有效。对照毒素产量为 27.2、30.7、21.2 μg/ml 培养液（第3天）。
研究结论
本研究建立了以 Tri4 为靶标的 trichothecene 生物合成抑制剂筛选系统，可用于快速鉴定先导化合物，并为设计抗真菌代谢修饰的抑制剂提供工具。