Utilization of the recombinant human \(\beta\) -carotene-15,15'-monooxygenase gene in Escherichia coli and mammalian cells
- 作者
- Chan-Soo Park, Sang-Wang Lee, Yeong-Su Kim, Eun-Joo Kim, Hong-Sig Sin, Deok-Kun Oh, Seon-Won Kim, Soo-Jong Um
- 单位
- Department of Bioscience & Biotechnology/Institute of Bioscience, Sejong University; Department of Bioscience & Biotechnology, Konkuk University; Chebigen Inc., Sejong University; Department of Food Science & Nutrition, Gyeongsang National University
- 杂志
- Biotechnology Letters（2007）
- DOI
- 10.1007/s10529-007-9598-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
人β-胡萝卜素15,15'-单加氧酶（BCMO）天然活性不足以满足工业化生产视网膜的需求，需要提高其酶活性。
研究策略
利用产β-胡萝卜素的大肠杆菌进行颜色筛选，通过随机突变获得高活性BCMO突变体；纯化野生型和突变体蛋白并测定动力学参数；通过哺乳动物细胞中的维甲酸受体报告基因系统验证BCMO功能。
研究路线图
核心内容
该研究针对人β-胡萝卜素15,15'-单加氧酶（BCMO）天然活性不足、难以满足工业化生产视网膜需求的问题，建立了一套基于大肠杆菌和哺乳动物细胞的体内筛选系统。研究者利用产β-胡萝卜素的大肠杆菌进行颜色筛选，通过随机突变获得高活性BCMO突变体，并纯化野生型及突变体蛋白测定动力学参数，同时借助HeLa细胞中维甲酸受体报告基因系统验证突变体功能。结果显示，T381L突变体对β-胡萝卜素的催化效率（Vmax/Km）比野生型高1.5倍，其Km为28±1.0 μM，Vmax为1.5±0.07 μmol min⁻¹ mg⁻¹；在1 mg酶/L和200 mg β-胡萝卜素/L条件下反应180 min，T381L产生35 mg视网膜/L，较野生型的20 mg/L提高1.7倍。该研究建立的筛选体系可有效鉴定高活性BCMO突变体，为工业及药理学应用中利用β-胡萝卜素生产视网膜的酶改良提供了可行工具。
创新点
建立基于大肠杆菌颜色变化和哺乳动物细胞报告基因的体内筛选系统，用于筛选更高活性的BCMO突变体，无需繁琐的体外酶活测定。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | β-胡萝卜素裂解为视网膜 | 人BCMO（野生型） | His标签BCMO蛋白 | 催化 | 用于表达和纯化重组人BCMO蛋白 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | β-胡萝卜素裂解为视网膜 | 人BCMO（T381L突变体） | His标签BCMO T381L突变体蛋白 | 催化 | 用于动力学参数测定，Vmax较野生型提高 |
| Escherichia coli DH5α（含pAC-BETA04，产β-胡萝卜素） | β-胡萝卜素生物合成及裂解 | 人BCMO（野生型与突变体） | GST-BCMO融合蛋白 | 催化 | 利用颜色从黄色变为白色筛选高活性BCMO突变体 |
| HeLa细胞 | 维甲酸信号通路（β-胡萝卜素→视网膜→维甲酸） | 人BCMO | Flag-BCMO融合蛋白 | 催化 | 通过RARE-tk-荧光素酶报告基因验证BCMO在哺乳动物细胞中的功能 |
关键发现
- T381L突变体对β-胡萝卜素的催化效率（Vmax/Km）比野生型高1.5倍
- 在1 mg酶/L和200 mg β-胡萝卜素/L反应条件下，180 min后野生型产生20 mg视网膜/L，T381L产生35 mg视网膜/L，产量提高1.7倍
- 野生型Km为31±2.5 μM，Vmax为1.1±0.05 μmol min⁻¹ mg⁻¹，突变体Km为28±1.0 μM，Vmax为1.5±0.07 μmol min⁻¹ mg⁻¹。
研究结论
所建立的大肠杆菌颜色筛选和哺乳动物细胞报告基因系统可有效筛选高活性BCMO突变体，该体系可用于工业和药理学上从β-胡萝卜素生产视网膜的酶改良。