Squalene-hopeine cyclase (Spterp25) from Streptomyces peucetius: sequence analysis, expression and functional characterization
- 作者
- Gopal Prasad Ghimire, Tae-Jin Oh, Hei Chan Lee, Jae Kyung Sohng
- 杂志
- Biotechnology Letters（2008）
- DOI
- 10.1007/s10529-008-9903-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从 Streptomyces peucetius 中鉴定并功能表征一个推测的角鲨烯-藿烯环化酶基因 spterp25，验证其编码蛋白是否能够催化角鲨烯环化生成藿烯，从而参与hopanoid生物合成。
研究策略
通过序列比对分析 spterp25 编码蛋白与已知角鲨烯-藿烯环化酶的同源性；将该基因克隆到 pET32a(+) 载体并在 E. coli BL21(DE3)pLysS 中异源表达；纯化重组蛋白后进行体外酶活测定，利用 GC/MS 鉴定催化产物。
研究路线图
核心内容
本研究从 Streptomyces peucetius 中克隆了推测的角鲨烯-藿烯环化酶基因 spterp25，该基因全长 2025 bp，编码 674 个氨基酸。序列分析显示其编码蛋白含有八个重复的 QW 基序和一个保守的天冬氨酸富集域，与已知角鲨烯-藿烯环化酶具有同源性。将该基因克隆至 pET32a(+) 载体并在大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 中异源表达，纯化后的重组蛋白经 SDS-PAGE 显示表观分子量约 92 kDa。体外酶活测定表明，该酶在 35-45°C 和 pH 6.8 条件下活性最高，催化角鲨烯环化生成五环三萜化合物藿烯，产物经 GC/MS 鉴定，保留时间为 12.69 min，质谱分子离子峰 m/z=410，基峰 m/z=191，而空载体对照未检测到该产物。上述结果首次从功能上证实 Spterp25 是参与 hopanoid 生物合成的关键环化酶，为理解该类酶的催化机制和异源表达策略提供了实验依据。
创新点
首次从 Streptomyces peucetius 中克隆并异源表达了角鲨烯-藿烯环化酶；通过序列分析发现该酶含有八个重复的 QW 基序和一个保守的天冬氨酸富集域；利用 GC/MS 确认了催化产物为 hopene（藿烯），为 hopanoid 生物合成途径提供了功能证据。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | hopanoid生物合成 | spterp25 | Spterp25 (squalene-hopene cyclase) | 催化 | 异源表达宿主，用于重组蛋白表达与体外酶活测定 |
| Streptomyces peucetius | hopanoid生物合成 | spterp25 | Spterp25 (squalene-hopene cyclase) | 催化 | 基因来源菌株，其基因组中克隆得到spterp25 |
关键发现
- 克隆的 spterp25 基因长 2025 bp，编码 674 个氨基酸；重组蛋白经 SDS-PAGE 表观分子量约 92 kDa；酶活性最适温度为 35-45°C，最适 pH 为
- 8；体外反应产物经 GC/MS 鉴定为 hopene，保留时间
- 69 min，质谱分子离子峰 m/z=410，基峰 m/z=191；空载体对照未检测到 hopene。
研究结论
序列分析和酶学转化实验共同证实 stperp25 基因编码一个功能性的角鲨烯-藿烯环化酶，该酶催化角鲨烯环化生成五环三萜化合物藿烯，是 hopanoid 生物合成中的关键酶。