High versus low level expression of the lycopene biosynthesis genes from Pantoea ananatis in Escherichia coli
- 作者
- Christoph Albermann
- 杂志
- Biotechnology Letters（2010）
- DOI
- 10.1007/s10529-010-0422-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究番茄红素合成基因crtE、crtB、crtI在大肠杆菌中不同表达水平（染色体单拷贝整合 vs 多拷贝质粒表达）对番茄红素产量和产物特异性的影响，并探索代谢负担和副反应问题。
研究策略
构建不同的重组大肠杆菌菌株，组合染色体单拷贝和质粒多拷贝表达crtE/crtB/crtI基因，通过IPTG诱导控制表达水平，分析类胡萝卜素产物积累和细胞生长情况。
核心内容
本研究在大肠杆菌中系统比较了来自菠萝泛菌的番茄红素合成基因crtE、crtB、crtI在不同表达水平下的代谢效果。通过构建染色体单拷贝整合与质粒多拷贝表达的组合菌株，并辅以IPTG诱导控制表达强度，分析了类胡萝卜素产物谱与细胞生长的变化。结果显示，三基因染色体单拷贝表达的菌株BW-Lyco番茄红素产量最高，达3.9 mg/l（1.65 mg/g细胞干重），增强MEP途径dxs/idi/ispA后进一步提升至8.72 mg/l（4.45 mg/g cdw），比质粒表达基因簇的产量高出约90%。值得注意的是，高表达crtI会使主要产物从番茄红素转变为四脱氢番茄红素，在1 mM IPTG诱导下该产物可占总类胡萝卜素的80%，为稀有类胡萝卜素的定向制备提供了可行策略。研究揭示异源类胡萝卜素合成需根据目标产物精细调控基因表达水平，以避免代谢负担与副反应，单拷贝染色体表达更利于番茄红素积累。
创新点
发现高表达crtI会导致主要产物从番茄红素转变为四脱氢番茄红素（TDHL），最高占所有类胡萝卜素的80%，为稀有类胡萝卜素的制备提供了新方法；同时证明单拷贝染色体整合表达比质粒表达基因簇的番茄红素产量高约90%。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BW25113 lac+ | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 (CrtE) | 催化 | 催化FPP与IPP缩合生成GGPP，是番茄红素合成的限速步骤之一。 |
| Escherichia coli BW25113 lac+ | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 (CrtB) | 催化 | 催化两分子GGPP生成八氢番茄红素，高表达时可能对细胞产生毒性或蛋白负担。 |
| Escherichia coli BW25113 lac+ | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱饱和酶 (CrtI) | 催化 | 催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素，高表达时进一步脱氢生成四脱氢番茄红素（TDHL）。 |
| Escherichia coli BW25113 lac+ | 甲基赤藓醇磷酸途径 (MEP) | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 来自质粒pJOE5559，增强异戊二烯前体供给。 |
| Escherichia coli BW25113 lac+ | 甲基赤藓醇磷酸途径 (MEP) | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 来自质粒pJOE5559，增强异戊二烯前体供给。 |
| Escherichia coli BW25113 lac+ | 甲基赤藓醇磷酸途径 (MEP) | ispA | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 来自质粒pJOE5559，增强FPP前体供给。 |
关键发现
- E. coli BW-Lyco（三基因染色体单拷贝）番茄红素产量最高，达3.9±0.1 mg/l（1.65±0.12 mg/g cdw）
- 增强dxs/idi/ispA后产量升至8.72±0.21 mg/l（4.45±0.32 mg/g cdw）
- 质粒表达crtEBI（pCAS58）未诱导时产量为1.77±0.23 mg/l（0.84±0.11 mg/g cdw）
- E. coli BW-BE pJF119-crtI在0.5 mM IPTG诱导下TDHL达253±33 μg/g cdw（占59%），1 mM IPTG时TDHL占80%（169±27 μg/g cdw）
- 单拷贝染色体表达比质粒表达基因簇的番茄红素产量高约90%。
研究结论
异源生物合成类胡萝卜素需要根据目标调整基因表达水平，以避免代谢负担和非特异性副反应；高表达crtI可定向合成四脱氢番茄红素，且单拷贝染色体表达有利于番茄红素积累。