高级醇 · 代谢工程文献库

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A Mitogen-Activated Protein Kinase Tmk3 Participates in High Osmolarity Resistance, Cell Wall Integrity Maintenance and Cellulase Production Regulation in Trichoderma reesei

作者
Mingyu Wang, Qiushuang Zhao, Jinghua Yang, Baojie Jiang, Fangzhong Wang, Kuimei Liu, Xu Fang
单位
State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan, China; National Glycoengineering Research Center, Shandong University, Jinan, China; Department of Surgery, VA Boston Healthcare System, Boston University, Boston, Massachusetts, United States of America; Cancer Research Center, Shandong University School of Medicine, Jinan, China
杂志
PLoS ONE（2013）
DOI
10.1371/journal.pone.0072189
所属领域
发酵工程
关键词
Tmk3丝裂原活化蛋白激酶纤维素酶生产细胞壁完整性里氏木霉高渗抗性
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解决的核心问题

解析里氏木霉中Hog1型丝裂原活化蛋白激酶Tmk3的生理功能，特别是其在高渗抗性、细胞壁完整性维持和纤维素酶生产调控中的作用。

研究策略

构建tmk3基因敲除菌株，通过表型分析（耐盐、细胞壁干扰物敏感性、菌丝形态）、转录分析（实时定量PCR）和生化测定（几丁质含量、纤维素酶活），比较突变株与亲本株在液体和固态培养条件下的表现。

研究路线图

100%
研究对象：里氏木霉Tmk3激酶
研究问题：Tmk3在'高渗抗性/细胞壁/纤维素酶'中的功能
策略：构建Δtmk3敲除菌株
表型分析：高渗、细胞壁干扰物、形态
转录分析：qPCR（渗透/壁/纤维素酶基因）
生化测定：几丁质含量、纤维素酶活
关键发现：高渗与细胞壁缺陷；纤维素酶基因大幅下调；固态培养可恢复
结论：Tmk3调控高渗抗性、壁完整性与产酶；固态条件更适宜功能解析
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核心内容

该研究通过构建里氏木霉tmk3基因敲除菌株，系统解析了Hog1型丝裂原活化蛋白激酶Tmk3的生理功能。表型分析显示，Δtmk3菌株在0.5 M NaCl条件下即停止生长，而亲本菌株可耐受0.9 M NaCl，且突变株对荧光增白剂和刚果红高度敏感，在125 mg/L刚果红或30 mg/L荧光增白剂下无法生长，提示Tmk3参与高渗抗性与细胞壁完整性维持。定量PCR分析表明，tmk3缺失导致几丁质合酶和β-1,3-葡聚糖合酶基因转录下调2至8倍，菌株几丁质含量由4.19%降至3.48%。在液体培养条件下，主要纤维素酶基因cbh1、cbh2、egl1、egl2表达下调73至93倍，纤维素酶活显著下降；而固态培养可大幅恢复这些基因的表达，bxl1甚至上调4.4倍。结果表明Tmk3通过调控渗透稳定剂合成基因去抑制、维持细胞壁完整性及正向调控纤维素酶基因表达发挥作用，同时揭示固态培养条件更接近里氏木霉的天然生理状态，单纯依赖液体培养可能低估该菌的生产潜力。

创新点

首次在里氏木霉中研究MAPK信号通路的功能；发现Hog1型MAPK Tmk3参与细胞壁完整性维持（此前未见报道）；揭示Tmk3通过去抑制渗透稳定剂合成基因参与高渗抗性；发现固态培养可显著恢复tmk3缺失导致的生长和纤维素酶生产缺陷。

研究对象（27）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Trichoderma reesei MAPK信号通路（HOG1型） tmk3 Tmk3 调控 Hog1型MAPK，参与高渗抗性、细胞壁完整性和纤维素酶生产调控
Trichoderma reesei 甘油生物合成（渗透压调节） Trire2_76620 甘油-3-磷酸脱氢酶 催化 催化甘油合成，响应高渗胁迫
Trichoderma reesei 甘油生物合成（渗透压调节） Trire2_2574 甘油-3-磷酸脱氢酶 催化 催化甘油合成，响应高渗胁迫
Trichoderma reesei 海藻糖生物合成（渗透压调节） Trire2_75295 α,α-海藻糖-6-磷酸合酶 催化 催化海藻糖合成
Trichoderma reesei 海藻糖生物合成（渗透压调节） Trire2_77602 α,α-海藻糖-6-磷酸合酶 催化 催化海藻糖合成
Trichoderma reesei 海藻糖生物合成（渗透压调节） Trire2_121491 α,α-海藻糖-6-磷酸合酶 催化 催化海藻糖合成
Trichoderma reesei 海藻糖生物合成（渗透压调节） Trire2_73134 α,α-海藻糖-6-磷酸合酶 催化 催化海藻糖合成
Trichoderma reesei 海藻糖生物合成（渗透压调节） Trire2_48707 α,α-海藻糖-6-磷酸合酶 催化 催化海藻糖合成
Trichoderma reesei 细胞壁合成（几丁质） Trire2_112271 几丁质合酶 催化 参与几丁质合成
Trichoderma reesei 细胞壁合成（几丁质） Trire2_58188 几丁质合酶 催化 参与几丁质合成
Trichoderma reesei 细胞壁合成（几丁质） Trire2_55341 几丁质合酶 催化 参与几丁质合成
Trichoderma reesei 细胞壁合成（几丁质） Trire2_51492 几丁质合酶 催化 参与几丁质合成
Trichoderma reesei 细胞壁合成（几丁质） Trire2_124228 几丁质合酶 催化 参与几丁质合成
Trichoderma reesei 细胞壁合成（几丁质） Trire2_122172 几丁质合酶 催化 参与几丁质合成
Trichoderma reesei 细胞壁合成（几丁质） Trire2_71563 几丁质合酶 催化 参与几丁质合成
Trichoderma reesei 细胞壁合成（几丁质） Trire2_67600 几丁质合酶 催化 参与几丁质合成
Trichoderma reesei 细胞壁合成（β-1,3-葡聚糖） Trire2_78176 β-1,3-葡聚糖合酶 催化 编码fks基因，参与β-1,3-葡聚糖合成
Trichoderma reesei 纤维素降解 cbh1 纤维二糖水解酶I（CBHI） 催化 主要纤维素酶，降解结晶纤维素
Trichoderma reesei 纤维素降解 cbh2 纤维二糖水解酶II（CBHII） 催化 降解纤维素
Trichoderma reesei 纤维素降解 egl1 内切葡聚糖酶I（EGI） 催化 降解纤维素无定形区
Trichoderma reesei 纤维素降解 egl2 内切葡聚糖酶II（EGII） 催化 降解纤维素无定形区
Trichoderma reesei 纤维素降解 bgl1 β-葡萄糖苷酶I（BGI） 催化 将纤维二糖水解为葡萄糖
Trichoderma reesei 半纤维素降解 bxl1 β-木糖苷酶I（BXL1） 催化 水解木二糖等
Trichoderma reesei 纤维素酶基因表达调控 cre1 Cre1 调控 碳代谢物阻遏转录因子，含MAPK磷酸化位点
Trichoderma reesei 纤维素酶基因表达调控 xyr1 Xyr1 调控 纤维素酶基因的主要转录激活因子，含MAPK磷酸化位点
Trichoderma reesei 纤维素酶基因表达调控 ace1 ACEI 调控 纤维素酶基因的转录抑制因子，含多个MAPK磷酸化位点
Trichoderma reesei 纤维素酶基因表达调控 ace2 ACEII 调控 纤维素酶基因的转录激活因子，含MAPK磷酸化位点

关键发现

  1. Δtmk3菌株在0.5 M NaCl条件下停止生长，而亲本菌株可在0.9 M NaCl下生长
  2. Δtmk3对CR和CFW高度敏感，在125 mg/L CR或30 mg/L CFW下不能生长，而亲本可耐受200 mg/L CR和40 mg/L CFW
  3. 几丁质含量从亲本的4.19%降至3.48%（占干重）
  4. 几丁质合酶和β-1,3-葡聚糖合酶基因转录下调2~8倍
  5. 在液体培养中，纤维素酶基因cbh1、cbh2、egl1、egl2分别下调93、80、93、73倍，bgl1下调5.5倍，bxl1下调4.9倍
  6. 固态培养时，这些基因表达恢复（下调幅度降至1.2~2.6倍），bxl1反而上调4.4倍
  7. 纤维素酶活显著下降。

研究结论

Tmk3参与里氏木霉的高渗抗性（通过去抑制渗透稳定剂合成基因）、细胞壁完整性维持和纤维素酶生产调控；固态培养能部分恢复tmk3缺失造成的缺陷，表明里氏木霉更适应固态生长，液体培养条件可能误导对其生理的研究。