L-Arabinose pathway engineering for arabitol-free xylitol production in Candida tropicalis
- 作者
- Byoung Hoon Yoon, Woo Young Jeon, Woo Yong Shim, Jung Hoe Kim
- 单位
- Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology
- 杂志
- Biotechnology Letters（2010）
- DOI
- 10.1007/s10529-010-0487-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在木糖醇生产中，内源木糖还原酶（XR）底物谱广，会将半纤维素水解液中的L-阿拉伯糖还原为副产物阿拉伯醇，干扰木糖醇的结晶和下游纯化。
研究策略
用偏好D-木糖的异源XR（NcXR突变体）替换Candida tropicalis中偏好L-阿拉伯糖的内源XR，并引入细菌L-阿拉伯糖利用途径（araA、araB、araD），使L-阿拉伯糖用于细胞生长而非生成阿拉伯醇。
核心内容
针对半纤维素水解液中L-阿拉伯糖被内源木糖还原酶还原为阿拉伯醇、干扰木糖醇纯化的问题，该研究对热带假丝酵母进行代谢工程改造。研究者完全敲除菌株中4拷贝的XYL1基因，以消除偏好L-阿拉伯糖的内源XR活性，代之表达经五点突变的粗糙脉孢菌XR以增强D-木糖偏好性，并引入地衣芽孢杆菌araA及大肠杆菌araB、araD基因构建L-阿拉伯糖同化途径。重组菌株JY在发酵中完全不再产生阿拉伯醇，而是将10.5 g/L L-阿拉伯糖用于细胞生长，最高细胞密度达17 g/L，远超对照菌株；其木糖醇生产率为0.64 g/L/h，较对照菌株BSXDH-3的0.45 g/L/h提高42%。所有菌株木糖醇产率均接近理论最大值。该策略通过改变底物偏好并引导副产物前体进入细胞生长代谢，有效消除了阿拉伯醇副产物并提升木糖醇生产效率，为利用半纤维素混合糖生产木糖醇提供了可行方案。
创新点
['完全敲除C. tropicalis中4拷贝的XYL1基因，消除内源L-阿拉伯糖偏好性XR活性', '表达经5点突变（L102V、L107M、L109Q、I110C、V114I）的粗糙脉孢菌XR（NXRG-Mut5），提高D-木糖偏好性', '分别将Bacillus licheniformis的araA和Escherichia coli的araB、araD进行密码子优化并在C. tropicalis中功能表达，实现L-阿拉伯糖的高效同化', '构建的菌株JY在发酵中完全不产生阿拉伯醇，且木糖醇生产率显著提高']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Candida tropicalis BSXDH-3 | D-木糖还原为木糖醇 | XYL1 | 内源木糖还原酶（CtXR） | 催化 | 偏好L-阿拉伯糖，在BSXDH-3中有4拷贝，被完全敲除后得到菌株K1 |
| Candida tropicalis K1 | D-木糖还原为木糖醇 | XYL1 | 内源木糖还原酶（CtXR） | 催化 | 4拷贝全部敲除，XR活性不可检测 |
| Candida tropicalis KNV | D-木糖还原为木糖醇 | NXRG-Mut5 | 突变粗糙脉孢菌木糖还原酶 | 催化 | 含5个点突变（L102V、L107M、L109Q、I110C、V114I），偏好D-木糖，对L-阿拉伯糖活性较内源XR降低95% |
| Candida tropicalis JY | L-阿拉伯糖利用途径 | araA | L-阿拉伯糖异构酶（AI） | 催化 | 来源于Bacillus licheniformis，密码子优化为CoAraA，将L-阿拉伯糖异构化为L-核酮糖 |
| Candida tropicalis JY | L-阿拉伯糖利用途径 | araB | L-核酮糖激酶（RK） | 催化 | 来源于Escherichia coli，密码子优化为CoAraB，磷酸化L-核酮糖生成L-核酮糖-5-磷酸 |
| Candida tropicalis JY | L-阿拉伯糖利用途径 | araD | L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶（RPE） | 催化 | 来源于Escherichia coli，密码子优化为CoAraD，将L-核酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖-5-磷酸，进入磷酸戊糖途径 |
| Candida tropicalis BSXDH-3 | 木糖醇代谢 | XYL2 | 木糖醇脱氢酶（XDH） | 催化 | 已被敲除以阻断木糖醇进一步代谢，使木糖醇产率接近理论最大值 |
关键发现
- 对照菌株BSXDH-3和KNV分别将9.9 g/L L-阿拉伯糖转化为9.5 g/L和8.3 g/L阿拉伯醇，而重组菌株JY消耗10.5 g/L L-阿拉伯糖用于细胞生长，不形成阿拉伯醇
- JY的木糖醇生产率（0.64 g/L/h）比BSXDH-3（0.45 g/L/h）高42%，比KNV（0.55 g/L/h）高16%
- KNV对D-木糖的XR活性为80±6.6 mU/mg蛋白，对L-阿拉伯糖为5.8±0.6 mU/mg，选择性（L-阿拉伯糖/D-木糖活性比）仅为7.3%，而BSXDH-3为144%
- JY最高细胞密度达17 g/L，远高于BSXDH-3的7.8 g/L和KNV的9.1 g/L
- 所有菌株的木糖醇产率均接近理论最大值（97-99%）。
研究结论
通过替换XR的底物偏好并引入细菌L-阿拉伯糖利用途径，成功构建了Candida tropicalis重组菌株JY，在木糖醇发酵中完全消除了阿拉伯醇副产物，同时提高了木糖醇的生产率，为利用半纤维素来源的混合糖生产木糖醇提供了有效策略。