Engineering of geranylgeranyl pyrophosphate synthase levels and physiological conditions for enhanced carotenoid and astaxanthin synthesis in Xanthophyllomyces dendrorhous

作者: Jürgen Breitenbach, Hans Visser, Jan C. Verdoes, Albert J. J. van Ooyen, Gerhard Sandmann
单位: Molecular Biosciences 213, J.W. Goethe Universität, Frankfurt, Germany; Division of Industrial Microbiology, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands; Section of Fungal Genomics, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands
杂志: Biotechnology Letters（2010）
DOI: 10.1007/s10529-010-0495-2
所属领域: 代谢工程
关键词: 3-hydroxy-4-keto-toruleneCarotenoid biosynthesisGeranylgeranyl pyrophosphate synthaseLight enhancement
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解决的核心问题

提高红法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）中虾青素及其它类胡萝卜素的产量，通过增强萜类前体供应和优化培养条件来解除合成瓶颈。

研究策略

克隆并过表达自身香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）合酶基因crtE，将代谢流从甾醇途径转向类胡萝卜素合成，并结合光照和通气等生理条件的优化。

研究路线图

100%

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核心内容

该研究在红法夫酵母中过表达内源香叶基香叶基焦磷酸合酶基因crtE，以增强萜类前体供应、促进类胡萝卜素和虾青素积累。在大肠杆菌中经功能互补验证，crtE编码GGPP合酶，其表达使类胡萝卜素含量从4 μg/g dw提升至128 μg/g dw，超过30倍。获得的酵母转化株总类胡萝卜素含量达288 μg/g dw，比野生型的198 μg/g dw提高约1.5倍，crtE转录水平上升10倍。光照和额外通气处理在野生型与转化株中均能独立提高类胡萝卜素积累，并与crtE过表达呈叠加效应。在最优的光照和高氧条件下，转化株虾青素产量达452 μg/g dw，为原始野生型暗培养低氧条件下的8倍。然而，虾青素仅占总类胡萝卜素的43%，其余为酮类中间产物，说明最终合成步骤仍受限。结果表明过表达crtE能有效分流法尼基焦磷酸并增强类胡萝卜素合成，光照与通气条件可协同促进虾青素生成；但若要实现更高产量，还需同时过表达crtYB和asy基因以解除下游瓶颈，推动红法夫酵母成为具经济竞争力的虾青素生产菌株。

创新点

首次在X. dendrorhous中过表达内源crtE基因，并系统评估了光照、氧气供应与基因过表达的叠加效应，实现虾青素产量的大幅提升。

研究对象（5）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Xanthophyllomyces dendrorhous CBS6938	类胡萝卜素生物合成	crtE	香叶基香叶基焦磷酸合酶（GGPP synthase）	催化	编码GGPP合酶，将FPP转化为GGPP，过表达可增强类胡萝卜素前体供应。
Escherichia coli (DH5α, XL1-Blue MFR, JM101)	类胡萝卜素生物合成（异源）	crtE	香叶基香叶基焦磷酸合酶（GGPP synthase）	催化	用于功能互补验证，与pACCAR25ΔcrtE共转化恢复类胡萝卜素合成。
Xanthophyllomyces dendrorhous CBS6938	类胡萝卜素生物合成	crtYB	八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶（phytoene synthase/lycopene cyclase）	催化	融合基因，催化八氢番茄红素合成及番茄红素环化。
Xanthophyllomyces dendrorhous CBS6938	类胡萝卜素生物合成	crtI	八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase）	催化	催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素和3,4-二氢番茄红素。
Xanthophyllomyces dendrorhous CBS6938	类胡萝卜素生物合成	asy	虾青素合酶（astaxanthin synthase）	催化	催化β-胡萝卜素经多步转化为虾青素，是终产物合成的关键酶。

关键发现

在E. coli中功能性互补验证表明，crtE编码GGPP合酶，crtE表达使类胡萝卜素含量从4 μg/g dw提高到128 μg/g dw（超过30倍）。获得的X. dendrorhous转化株总类胡萝卜素含量达288 μg/g dw（比野生型198 μg/g dw高1.3-1.5倍），crtE转录水平提高10倍。在野生型和转化株中，光照和额外通气均能提高类胡萝卜素积累，且二者与crtE过表达具有叠加效应。最优条件（光照+高氧）下，crtE转化株虾青素产量达452 μg/g dw，是原始野生型暗培养低氧条件下（57 μg/g dw）的8倍。即使最优条件下，虾青素仍只占总类胡萝卜素的43%，其余为未完全转化的酮类中间产物。

研究结论

过表达crtE能有效分流FPP并增强类胡萝卜素合成，光照和通气条件可独立且叠加地促进虾青素积累。为进一步提高虾青素产量，未来需同时过表达crtE、crtYB和asy基因，以解除最终合成步骤的限制，使X. dendrorhous成为具有经济竞争力的虾青素细胞工厂。