Fermentation of glycerol and production of valuable chemical and biofuel molecules
- 作者
- Anu Jose Mattam, James M. Clomburg, Ramon Gonzalez, Syed Shams Yazdani
- 杂志
- Biotechnology Letters（2013）
- DOI
- 10.1007/s10529-013-1240-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用生物柴油副产物甘油作为碳源，通过天然或代谢工程改造的微生物高效生产有价值化学品和生物燃料，以解决甘油过剩问题并提高生物燃料经济性。
研究策略
系统综述甘油发酵的优势（还原性高、产生更多还原当量），总结天然微生物和代谢工程菌株利用甘油生产1,3-丙二醇、乙醇、丁醇、琥珀酸、PHB等多种化学品和燃料的研究进展，并比较不同工程策略（如基因敲除、异源表达、合成操纵子等）的效果。
核心内容
该文系统综述了以生物柴油副产物甘油为碳源，通过天然及代谢工程改造微生物生产高值化学品和生物燃料的研究进展。甘油因还原性高于葡萄糖和木糖，可在生物转化中提供更多还原当量，有利于还原性产物合成。文中比较了多种工程策略，包括基因敲除、异源表达和操纵子组装等。关键结果显示，野生型大肠杆菌以甘油为唯一碳源时，乙醇产率达理论最大值的86%，而葡萄糖仅为29%；工程菌株表达DhaB1/DhaB2/YqhD后，1,3-丙二醇产量达104 g/L，产率为2.6 g/L/h，为理论得率的90%。此外，肺炎克雷伯菌连续发酵产1,3-丙二醇浓度达48.5 g/L，丁酸梭菌和氧化葡萄糖酸杆菌突变株分别产1,3-丙二醇67.9 g/L和二羟基丙酮209.6 g/L。该综述表明甘油作为丰富廉价碳源具有显著优势，代谢工程拓宽了产物谱，结合合成生物学工具可进一步提升甘油基生物炼制的商业化可行性。
创新点
总结并分析甘油相对于葡萄糖/木糖在还原产物产量上的优势；提出利用代谢工程和合成生物学手段开发甘油为原料的新途径；汇总多种微生物的产量参数并讨论工业化潜力。
研究对象（39）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 甘油发酵产乙醇 | — | — | — | 野生型菌株，主要产物乙醇，具体基因未在文中明确 |
| Escherichia coli | 1,3-丙二醇合成 | dhaB1,dhaB2,yqhD | DhaB1,DhaB2,YqhD | 催化 | 来自C. butyricum的dhaB1/dhaB2和E. coli的yqhD构建合成操纵子 |
| Escherichia coli | 1,2-丙二醇合成 | mgsA,gldA,yqhD,dhaK | MgsA,GldA,YqhD,DHAK | 催化 | 过表达甲基乙二醛合酶、甘油脱氢酶、醛氧化还原酶和来自C. freundii的ATP依赖性二羟丙酮激酶 |
| Escherichia coli | PHB合成 | phb | PhaC,PhaA,PhaB | 催化 | 来自Azotobacter sp.的PHB合成基因，在arcA突变体中表达 |
| Escherichia coli | 琥珀酸合成 | pyc | Pyruvate carboxylase | 催化 | 来自Lactococcus lactis的丙酮酸羧化酶，过表达以补充C4中间体 |
| Escherichia coli | 琥珀酸合成 | ptsI,pflB,pck | PtsI,PflB,Pck | 调控 | ptsI和pflB缺失，pck启动子上调（Pck为磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，通过启动子突变调节表达） |
| Escherichia coli | D-乳酸合成 | glpK,glpD,gldA,dhaK,ldhA | GlpK,GlpD,GldA,DHAK,LDH | 催化 | 过表达甘油激酶、甘油-3-磷酸脱氢酶等，以及D-乳酸脱氢酶，阻断竞争途径 |
| Klebsiella pneumoniae | 1,3-丙二醇合成 | cps | Cps | 调控 | 荚膜多糖基因失活，提高1,3-PDO产量到78 g/L |
| Klebsiella pneumoniae | 3-羟基丙酸和1,3-丙二醇共生产 | puuC | PuuC | 催化 | 过表达参与3-HP生产的醛脱氢酶 |
| Gluconobacter oxydans | 二羟基丙酮生产 | adhA | ADH | 催化 | 敲除膜结合醇脱氢酶，提高甘油浓度耐受和DHA产量 |
| Gluconobacter oxydans | 二羟基丙酮生产 | sldAB | SldAB | 催化 | 过表达甘油脱氢酶，增加DHA产量并降低抑制 |
| Corynebacterium glutamicum | 甘油利用和氨基酸生产 | glpK,glpD | GlpK,GlpD | 催化 | 表达E. coli甘油激酶和甘油-3-磷酸脱氢酶，实现以甘油为碳源生产谷氨酸和赖氨酸 |
| Corynebacterium glutamicum | 甘油转运 | glpF | GlpF | 转运 | aquaglyceroporin，促进甘油摄取 |
| Clostridium butyricum | 1,3-丙二醇合成 | — | — | — | 天然菌株，具有维生素B12非依赖型甘油脱水酶 |
| Clostridium pasteurianum | 1,3-丙二醇和丁醇 | — | — | — | 天然菌株，同时生产1,3-PDO和丁醇 |
| Kluyvera cryocrescens | 乙醇生产 | — | — | — | 天然菌株，利用粗甘油生产乙醇 |
| Enterobacter aerogenes | 氢气生产 | — | — | — | 天然菌株，从粗甘油产氢 |
| Halanaerobium saccharolyticum | 氢气生产 | — | — | — | 嗜盐菌，利用高盐粗甘油产氢 |
| Anaerobiospirillum succiniproducens | 琥珀酸合成 | — | — | — | 天然菌株，以甘油为唯一碳源产琥珀酸 |
| Actinobacillus succinogenes | 琥珀酸合成 | — | — | — | 天然菌株，产琥珀酸 |
| Pasteurellaceae strain DD1 | 琥珀酸合成 | — | — | — | 从牛瘤胃分离，利用粗甘油产琥珀酸 |
| Methylobacterium rhodesianum | PHB合成 | — | — | — | 与Ralstonia eutropha共培养，利用粗甘油 |
| Ralstonia eutropha | PHB合成 | — | — | — | 与Methylobacterium rhodesianum共培养 |
| Burkholderia cepacia | PHB合成 | — | — | — | 利用纯甘油和粗甘油产PHB |
| Vibrio sp. BM1 | PHB合成 | — | — | — | 海洋分离菌，产PHB |
| Zobellella denitrificans | PHB合成 | — | — | — | 耐盐菌，在20 g/L NaCl下仍能积累PHB |
| Yarrowia lipolytica | 柠檬酸合成 | — | — | — | 天然菌株或突变株，利用甘油产柠檬酸 |
| Propionibacterium acidipropionici | 丙酸合成 | — | — | — | 天然菌株，甘油为碳源产丙酸 |
| Streptomyces albulus | ε-聚赖氨酸合成 | — | — | — | UV/NTG突变株，利用甘油产ε-PL |
| Bacillus subtilis | γ-聚谷氨酸合成 | — | — | — | 天然菌株，甘油促进γ-PGA产量并降低分子量 |
| Serratia marcescens | 灵菌红素合成 | — | — | — | 利用粗甘油产灵菌红素 |
| Phaffia rhodozyma | 虾青素合成 | — | — | — | 利用粗甘油产虾青素 |
| Aspergillus flavus | 曲酸合成 | — | — | — | 利用甘油产曲酸 |
| Pseudomonas aeruginosa | 鼠李糖脂合成 | — | — | — | 利用粗甘油产鼠李糖脂 |
| Candida bombicola | 槐糖脂合成 | — | — | — | 利用粗甘油产槐糖脂 |
| Ustilago maydis | 糖脂合成 | — | — | — | 利用粗甘油产甘露糖赤藓醇脂等 |
| Chlorella protothecoides | 脂质合成 | — | — | — | 异养微藻，利用甘油产脂质 |
| Labyrinthulomycota (thraustochytrid) | 单细胞油合成 | — | — | — | 利用粗甘油产富含PUFA的微生物油 |
| Schizochytrium limacinum | DHA合成 | — | — | — | 海洋微藻，利用粗甘油产DHA |
关键发现
- 野生型E. coli以甘油为唯一碳源时，乙醇产率达理论最大值的86%，琥珀酸7%，乙酸和乳酸仅痕量
- 而以葡萄糖时乙醇和琥珀酸得率仅29%和6%，并积累乳酸和乙酸（45%和21%）。K. pneumoniae连续发酵产1,3-PDO浓度达35.2-48.5 g/L，体积产率8.8 g/L/h
- 添加富马酸后产率提高至1.29 g/L/h（增加约36%）。工程E. coli表达DhaB1/DhaB2/YqhD后，1,3-PDO产量达104 g/L，产率为2.6 g/L/h，达到理论得率的90%。工程E. coli产D-乳酸32 g/L，产率为理论最大值的85%。工程E. coli产琥珀酸，产率达0.69 g/g甘油，最大比生产速率约400 mg/g细胞/h。通过删除竞争途径基因，E. coli产乙醇得率接近理论最大值0.51 g/g。天然菌株中，Clostridium butyricum产1,3-PDO达67.9 g/L，产率0.5 g/g
- Klebsiella pneumoniae产1,3-PDO达71.58 g/L，产率0.78 g/g。Yarrowia lipolytica突变株产柠檬酸达154 g/L，产率0.78 g/g。Gluconobacter oxydans突变株产二羟基丙酮达209.6 g/L，产率0.90 g/g。
研究结论
甘油作为一种丰富且廉价的碳源，因其还原性高，能产生比葡萄糖/木糖更多的还原当量，因此在生物转化制备还原性燃料和化学品方面具有显著优势。天然微生物已能高效生产1,3-丙二醇、乙醇、丙酸、柠檬酸等产品；代谢工程进一步拓宽了产物谱，尤其在E. coli中实现了多种化合物的高效合成。未来结合合成生物学工具，有望进一步提高甘油基生物炼制过程的商业化可行性。