Production of \(\beta\) -apo-10'-carotenal from \(\beta\) -carotene by human \(\beta\) -carotene-9',10'-oxygenase expressed in E. coli
- 作者
- Yeong-Su Kim, Soo-Jin Yeom, Deok-Kun Oh
- 杂志
- Biotechnology Letters（2011）
- DOI
- 10.1007/s10529-011-0556-1
- 所属领域
- 生物催化/酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用在大肠杆菌中表达的人源β-胡萝卜素-9',10'-加氧酶（BCO2）高效酶法生产β-apo-10'-胡萝卜醛，并明确最优反应条件
研究策略
克隆人BCO2基因并在E. coli中表达纯化，系统优化有机溶剂、pH、温度、去污剂类型及浓度、底物和酶浓度等反应参数，在含去污剂胶束的水相中催化β-胡萝卜素裂解生成β-apo-10'-胡萝卜醛
核心内容
本研究首次报道利用在大肠杆菌中表达的人源β-胡萝卜素-9',10'-加氧酶（BCO2）酶法生产β-apo-10'-胡萝卜醛。研究人员克隆了人BCO2基因并在E. coli ER2566中表达纯化，系统优化了有机溶剂、pH、温度、去污剂类型及浓度、底物和酶浓度等反应参数。最优反应条件为pH 8.0、37°C、2.4% (w/v) Tween 40、300 mg β-胡萝卜素/l和0.3 U酶/ml，在此条件下21小时可产43 mg/l β-apo-10'-胡萝卜醛，转化率为14% (w/w)。酶学表征显示该酶为四聚体，单体分子量约58 kDa，Km为67 μM，kcat为0.32 min⁻¹。酶经纯化后比活达0.08 U/mg，并表现出随温度升高的热失活速率。该研究通过构建水相去污剂胶束催化体系，为类胡萝卜素裂解产物的生物制备提供了可行途径。
创新点
首次报道酶法生产β-apo-10'-胡萝卜醛；确定了甲苯为最佳有机溶剂（在考虑毒性后选择）、Tween 40为最佳去污剂，并建立了最优反应体系
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli ER2566 | 类胡萝卜素裂解代谢（β-胡萝卜素偏心裂解途径） | human BCO2 (beta-carotene-9',10'-oxygenase, GenBank BC041656) | 人源β-胡萝卜素-9',10'-加氧酶（BCO2） | 催化 | 催化β-胡萝卜素9',10'双键的断裂，生成β-apo-10'-胡萝卜醛和β-紫罗兰酮 |
关键发现
- 最优条件为pH
- 0、37°C、2.4% (w/v) Tween
- 300 mg β-胡萝卜素/l、0.3 U酶/ml；该条件下21 h产β-apo-10'-胡萝卜醛43 mg/l，转化率14% (w/w)；同时β-胡萝卜素被消耗82 mg/l（152 μM），按化学计量估算产物应为57 mg/l，实际产43 mg/l，反应中损失14 mg/l；酶动力学参数Km=67 μM，kcat=0.32 min⁻¹，kcat/Km=4.7 mM⁻¹ min⁻¹；酶纯化12倍，得率7.2%，比活0.08 U/mg；酶为四聚体，单体分子量约58 kDa；热失活半衰期在35、40、45、50、55°C下分别为326、247、191、84、22 min
研究结论
通过优化水相去污剂胶束反应体系，利用重组人BCO2成功实现了β-apo-10'-胡萝卜醛的酶法生产，为首次报道，该研究为类胡萝卜素裂解产物的生物制备提供了可行途径