Cloning, expression and characterization of meso-2,3-butanediol dehydrogenase from Klebsiella pneumoniae
- 作者
- Gen Lin Zhang, Cui Wei Wang, Chun Li
- 杂志
- Biotechnology Letters（2012）
- DOI
- 10.1007/s10529-012-0933-4
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并表征肺炎克雷伯氏菌XJ-Li的meso-2,3-丁二醇脱氢酶，揭示其酶学特性，为其在2,3-丁二醇生物合成及手性化合物合成中的应用提供基础。
研究策略
从Klebsiella pneumoniae XJ-Li基因组中PCR扩增budC基因，构建pET-28a(+)-budC重组质粒，转化E. coli BL21(DE3) pLys进行异源表达；通过Ni-NTA亲和层析和柱上复性纯化重组酶，并测定其最适pH、温度及底物特异性。
核心内容
该研究从肺炎克雷伯氏菌XJ-Li基因组中克隆了编码meso-2,3-丁二醇脱氢酶的budC基因，构建pET-28a(+)-budC重组质粒并在大肠杆菌BL21(DE3) pLys中实现异源表达。通过Ni-NTA亲和层析和柱上复性获得纯化的重组酶，并系统表征其酶学性质。该酶还原乙偶姻和氧化meso-2,3-丁二醇的比活力分别达到218 U/mg和66 U/mg，显著高于同类酶；最适温度均为35°C，最适pH分别为8.0和9.0。动力学分析显示，该酶对乙偶姻具有高亲和力（Km=0.65 mM），对meso-2,3-丁二醇的Km为13 mM，对NADH和NAD+的Km分别为0.05 mM和0.66 mM。底物特异性实验表明该酶具有高度立体特异性，对meso-2,3-丁二醇专一性最强，对2S,3S-2,3-丁二醇活性仅2 U/mg，对2R,3R-2,3-丁二醇、1,4-丁二醇和甘油几乎无活性。该酶属于短链脱氢酶/还原酶家族，兼具高活性和高立体特异性，且耐碱性环境，为构建高效催化乙偶姻还原为meso-2,3-丁二醇的生物催化体系及手性化合物合成提供了有潜力的工具。
创新点
获得高活性的meso-2,3-丁二醇脱氢酶，还原乙偶姻和氧化meso-2,3-丁二醇的比活力分别达218 U/mg和66 U/mg，显著高于同类酶；该酶具有高立体特异性，对meso-2,3-丁二醇具有专一性，且对乙偶姻具有高亲和力（Km=0.65 mM）。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) pLys | 2,3-丁二醇代谢 | budC | meso-2,3-butanediol dehydrogenase | 催化 | 异源表达宿主，重组酶主要以包涵体形式存在，经纯化复性后获得活性酶 |
| Klebsiella pneumoniae XJ-Li | 2,3-丁二醇代谢 | budC | meso-2,3-butanediol dehydrogenase | 催化 | budC基因来源菌株，天然产生meso-2,3-丁二醇 |
关键发现
- 重组meso-2,3-丁二醇脱氢酶经纯化复性后，还原乙偶姻活性为218 U/mg，氧化meso-2,3-丁二醇活性为66 U/mg
- 最适温度均为35°C，最适pH分别为8.0（还原）和9.0（氧化）
- 乙偶姻的Km为0.65 mM，meso-2,3-丁二醇的Km为13 mM，NADH的Km为0.05 mM，NAD+的Km为0.66 mM
- 对2R,3R-2,3-丁二醇、1,4-丁二醇和甘油的活性<0.1 U/mg，对2S,3S-2,3-丁二醇活性仅2 U/mg，表明高立体特异性。
研究结论
meso-2,3-丁二醇脱氢酶属于短链脱氢酶/还原酶家族，具有高活性和高立体特异性，能高效催化乙偶姻还原为meso-2,3-丁二醇，且耐碱性环境，为构建新型催化体系及合成手性化合物提供了潜在工具。