Lycopene production in recombinant strains of Escherichia coli is improved by knockout of the central carbon metabolism gene coding for glucose-6-phosphate dehydrogenase
- 作者
- Yan Zhou, Komi Nambou, Liuqing Wei, Jingjing Cao, Tadayuki Imanaka, Qiang Hua
- 杂志
- Biotechnology Letters（2013）
- DOI
- 10.1007/s10529-013-1317-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过敲除中心碳代谢基因和过表达MEP途径关键基因，提高大肠杆菌异源合成番茄红素的产量，并阐明其内在机制。
研究策略
分别敲除大肠杆菌中心碳代谢基因pgi、gdhA、zwf，并构建过表达idi、dxs、ispDF的质粒，组合敲除与过表达策略，结合qRT-PCR分析关键基因转录水平变化。
核心内容
本研究系统考察了敲除大肠杆菌中心碳代谢基因对番茄红素异源合成的影响，并探索了与MEP途径关键基因过表达的协同效应。作者分别敲除pgi、gdhA和zwf基因，并构建共表达idi、dxs、ispDF的质粒，组合运用两种策略，通过qRT-PCR分析关键基因转录水平变化。结果显示，zwf敲除可将番茄红素产量提升至2.52 mg/g DCW，较对照的1.09 mg/g DCW提高超过130%，显著优于其余两种敲除；单独过表达idi、dxs、ispDF也能将产量从0.89 mg/g DCW提升至5.39 mg/g DCW。将zwf敲除与三个基因的过表达组合后，产量进一步提升至最高7.55 mg/g DCW，并保持良好的菌株生长性能。转录分析揭示，zwf敲除通过上调idi和dxs的表达发挥作用，最优菌株中这两个基因的转录水平相对单敲除菌株提升逾百倍。该研究首次系统比较了三种中心碳代谢基因敲除的效果，证实zwf缺失与MEP途径过表达具有协同增益，为番茄红素乃至其他异戊二烯类化合物的微生物工业化生产提供了可行策略。
创新点
系统比较了pgi、gdhA、zwf三种中心碳代谢基因敲除对番茄红素合成的影响，首次发现zwf敲除通过上调idi和dxs表达显著增强番茄红素产量，且与MEP途径基因过表达具有协同效应。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BW25113 | 戊糖磷酸途径 | zwf | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，控制碳流进入戊糖磷酸途径；敲除该基因可增强番茄红素合成。 |
| Escherichia coli BW25113 | 糖酵解 | pgi | 葡萄糖磷酸异构酶 | 催化 | 编码葡萄糖磷酸异构酶，催化葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸；敲除该基因对番茄红素产量有负面影响。 |
| Escherichia coli BW25113 | 谷氨酸代谢/三羧酸循环 | gdhA | 谷氨酸脱氢酶 | 催化 | 编码谷氨酸脱氢酶，连接碳氮代谢；敲除该基因对番茄红素产量影响不显著。 |
| Escherichia coli BW25113 | MEP途径 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 关键限速酶，催化IPP与DMAPP相互转化；过表达可显著提高番茄红素产量。 |
| Escherichia coli BW25113 | MEP途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | MEP途径第一个关键酶，催化丙酮酸与G3P缩合；过表达显著增强番茄红素合成。 |
| Escherichia coli BW25113 | MEP途径 | ispD | 4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶 | 催化 | MEP途径酶，与ispF共同过表达有利于番茄红素积累。 |
| Escherichia coli BW25113 | MEP途径 | ispF | 2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶 | 催化 | MEP途径酶，与ispD共同过表达有利于番茄红素积累。 |
| Escherichia coli BW25113 | 类胡萝卜素合成途径 | crtE | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 来自Erwinia herbicola，由质粒pAC-LYC携带，催化GGPP合成。 |
| Escherichia coli BW25113 | 类胡萝卜素合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Erwinia herbicola，由质粒pAC-LYC携带，催化两分子GGPP生成八氢番茄红素。 |
| Escherichia coli BW25113 | 类胡萝卜素合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Erwinia herbicola，由质粒pAC-LYC携带，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素。 |
关键发现
- zwf敲除使番茄红素产量提高至2.52 mg/g DCW，相对对照(1.09 mg/g DCW)提高130%以上
- 过表达idi、dxs、ispDF将产量从0.89 mg/g DCW提高至5.39 mg/g DCW
- 组合敲除与过表达后产量达到6.85-7.55 mg/g DCW，其中BZL-PD菌株最高为7.55 mg/g DCW。过表达idi提高70.8%，idi+dxs相对idi提高182.2%，idi+dxs+ispDF相对idi+dxs提高25.6%。qRT-PCR显示BWL-PD菌株中idi和dxs分别上调22.6倍和33.6倍
- BPL-PD和BZL-PD中idi和dxs相对BWL-PD超过100倍，BGL-PD中分别为33.54倍和51.87倍。
研究结论
敲除zwf联合过表达idi、dxs、ispDF可显著提高大肠杆菌番茄红素产量，最优菌株BZL-PD的番茄红素含量达7.55 mg/g DCW，且生长性能良好，为番茄红素的工业化生产提供了可行策略。