Improved cellobiose utilization in E. coli by including both hydrolysis and phosphorylosis mechanisms
- 作者
- Charles Rutter, Rachel Chen
- 杂志
- Biotechnology Letters（2013）
- DOI
- 10.1007/s10529-013-1355-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决大肠杆菌无法直接利用纤维二糖的问题，通过同时引入水解和磷酸解机制提高纤维二糖利用率，并实现纤维二糖与木糖的同步共发酵，避免分解代谢物阻遏。
研究策略
在产2,3-丁二醇的大肠杆菌MGLAP菌株中，同时表达来自Saccharophagus degradans的纤维糊精酶Ced3A和纤维二糖磷酸化酶Cep94A，构建同时具有水解和磷酸解能力的菌株（CED+CBP），并比较单酶菌株（CED、CBP）和空载体对照在纤维二糖发酵及混合糖发酵中的性能。
核心内容
本研究在产2,3-丁二醇的大肠杆菌MGLAP菌株中同时表达来自解糖噬琼胶菌的纤维糊精酶Ced3A和纤维二糖磷酸化酶Cep94A，构建了兼具水解与磷酸解纤维二糖能力的双酶菌株（CED+CBP），并与单酶菌株和空载体对照进行比较。72小时厌氧发酵中，空载体几乎不消耗纤维二糖；36小时时单表达Ced3A和Cep94A的菌株分别残留0.7%和0.2%的纤维二糖，而双酶菌株仅残留约0.05%，并在约50小时内完全利用。双酶菌株与单表达Cep94A菌株均在48小时达到0.4%的meso-2,3-丁二醇（理论产率80%），单表达Ced3A菌株仅产0.07%。在纤维二糖与木糖混合发酵中，菌株同步消耗两种糖，1%纤维二糖加1%木糖组32小时内完全发酵，26小时即产0.72%的2,3-丁二醇，而葡萄糖加木糖组48小时仍残留约0.5%糖且木糖仅利用一半。结果表明，结合水解与磷酸解机制可显著加速纤维二糖利用，并借由细胞内纤维二糖代谢绕过分解代谢物阻遏，实现糖类同步利用，提升目标产物产量与产率，展示了该策略在生物炼制中的应用潜力。
创新点
首次将纤维二糖水解与磷酸解两种机制结合在大肠杆菌中，显著加速纤维二糖消耗；利用细胞内纤维二糖代谢绕过分解代谢物阻遏，实现纤维二糖和木糖同步利用，从而提高产物产量和缩短发酵时间。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MGLAP（MG1655衍生物，敲除乳酸和乙酸合成途径） | 纤维二糖利用 | ced3A | Ced3A（cellodextrinase） | 催化 | 来源于Saccharophagus degradans，催化纤维二糖水解为两分子葡萄糖 |
| Escherichia coli MGLAP（MG1655衍生物，敲除乳酸和乙酸合成途径） | 纤维二糖利用 | cep94A | Cep94A（cellobiose phosphorylase） | 催化 | 来源于Saccharophagus degradans，催化纤维二糖磷酸解为葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸 |
| Escherichia coli MGLAP（MG1655衍生物，敲除乳酸和乙酸合成途径） | meso-2,3-丁二醇合成 | — | 未具体列出的BDO合成酶系（由pBBDO质粒编码） | 催化 | 负责将代谢中间产物转化为meso-2,3-丁二醇，本研究将其作为模型产物 |
关键发现
- 在72h厌氧发酵中，空载体对照几乎不消耗纤维二糖
- 36h时，单表达CED的菌株残留0.7%（w/v）纤维二糖，单表达CBP的菌株残留0.2%，而双酶菌株（CED+CBP）残留约0.05%，并在约50h内完全利用纤维二糖。双酶菌株与CBP菌株均在48h达到最大0.4%（w/v）meso-2,3-丁二醇（BDO），理论产率80%
- 单表达CED菌株仅产生0.07% BDO。在0.5%纤维二糖+0.5%木糖混合发酵中，细胞同时消耗两种糖，最终BDO为0.3%（60%产率），伴随乙偶姻积累（BDO+乙偶姻总量0.4%或0.38%）。在1%纤维二糖+1%木糖混合发酵中，32h内完全发酵，而1%葡萄糖+1%木糖混合发酵48h仍残留约0.5%糖，木糖仅利用约50%
- 纤维二糖/木糖组在26h达到0.72% BDO，葡萄糖/木糖组36h才达到0.61%
- 两组BDO+乙偶姻总量分别为0.74%和0.91%。
研究结论
结合水解和磷酸解机制可显著提高大肠杆菌对纤维二糖的利用速率；细胞内纤维二糖代谢能绕过分解代谢物阻遏，实现纤维二糖与木糖的同步利用，加速整体碳代谢并提高目标产物（2,3-丁二醇）的产量和产率，显示了该工程菌株在生物炼制中的应用潜力。