Production of lycopene by metabolically-engineered Escherichia coli
- 作者
- Tao Sun, Liangtian Miao, Qingyan Li, Guanping Dai, Fuping Lu, Tao Liu, Xueli Zhang, Yanhe Ma
- 单位
- College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences
- 杂志
- Biotechnology Letters（2014）
- DOI
- 10.1007/s10529-014-1543-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过代谢工程改造大肠杆菌，使原产β-胡萝卜素的菌株转向高效生产番茄红素，并进一步提高产量，以满足工业化需求。
研究策略
删除β-胡萝卜素生产菌株CAR001中的crtX和crtY基因实现代谢流向番茄红素的转换；通过调控中心代谢模块（sucAB、sdhABCD、talB）增加NADPH和ATP供给；利用RBS文库精细调控dxs、idi及crt基因的表达水平，组合优化番茄红素合成通路。
核心内容
该研究通过组合代谢工程策略将大肠杆菌改造成高效生产番茄红素的细胞工厂。首先在产β-胡萝卜素菌株CAR001中敲除crtX和crtY基因，获得产番茄红素10.49 mg/L的LYC001菌株；随后调控中心碳代谢模块sucAB、sdhABCD和talB基因表达以增加NADPH和ATP供给，使产量提高76%至18.91 mg/L；最后利用RBS文库对dxs、idi及crt基因进行精细表达调控，获得菌株LYC010，摇瓶产量达26.33 mg/L（15.22 mg/g DCW），较LYC001提升133%。在补料分批发酵中，LYC010产量达到3.52 g/L，得率50.6 mg/g DCW，为当时工程大肠杆菌的最高水平。该研究证明中心代谢模块改造与关键基因RBS文库精细调控的组合策略能有效协同提升异戊二烯类化合物的合成效率，为类似天然产物的微生物生产提供了可行的方法学参考。
创新点
采用RBS文库对关键基因（dxs、idi、crt）进行精细表达调控，结合中心碳代谢模块改造，协同提升番茄红素产量；得到的LYC010菌株在补料分批发酵中产量和得率均达到当时工程大肠杆菌的最高水平。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtX | zeaxanthin glucosyltransferase | 催化 | 在CAR001中删除，避免玉米黄质等副产物生成，使代谢流向番茄红素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtY | lycopene β-cyclase | 催化 | 删除以阻断β-胡萝卜素合成，使菌株积累番茄红素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | geranylgeranyl diphosphate synthase | 催化 | 来自Pantoea agglomerans，使用RBS文库调节表达（LYC008中为crtE9） |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | phytoene synthase | 催化 | 参与番茄红素合成，保留于crtEIB操纵子中 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | phytoene desaturase | 催化 | 参与番茄红素合成，保留于crtEIB操纵子中 |
| Escherichia coli | MEP途径 | dxs | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | 异戊二烯前体合成关键酶，用RBS文库调节表达（LYC009中为dxs12） |
| Escherichia coli | MEP途径 | idi | isopentenyl diphosphate isomerase | 催化 | 催化IPP与DMAPP互变，用RBS文库调节表达（LYC010中为idi7） |
| Escherichia coli | TCA循环 | sucAB | α-ketoglutarate dehydrogenase | 催化 | 用M1-46调控部分上调表达，增强TCA循环通量，增加NADPH和ATP供给 |
| Escherichia coli | TCA循环 | sdhABCD | succinate dehydrogenase | 催化 | 用M1-46调控部分上调表达，增加NADPH和ATP供给 |
| Escherichia coli | 磷酸戊糖途径 | talB | transaldolase B | 催化 | 用M1-46调控部分上调表达，增强磷酸戊糖途径通量，增加NADPH供给 |
关键发现
- 敲除crtX和crtY后所得LYC001菌株产番茄红素10.49 mg/L（6.52 mg/g DCW）
- 调控sucAB、sdhABCD和talB基因表达后（LYC005）产量增至18.91 mg/L（11.53 mg/g DCW），相对提高76%
- 进一步用RBS文库优化dxs、idi和crt基因（LYC010）产量达26.33 mg/L（15.22 mg/g DCW），相对LYC001提高133%，其中RBS组合调控贡献32%的提升。补料分批发酵中，LYC001、LYC005和LYC010的番茄红素产量分别为0.47 g/L、0.95 g/L和3.52 g/L，得率分别为11.1 mg/g、21.3 mg/g和50.6 mg/g DCW，分别比摇瓶条件下提高79%、85%和233%。
研究结论
通过组合中心代谢模块改造与RBS文库精细调控，成功构建了高效生产番茄红素的大肠杆菌菌株LYC010，其补料分批发酵产量达3.52 g/L、得率50.6 mg/g DCW，为当时报道的工程大肠杆菌最高水平，证明了该组合策略对异戊二烯类化合物高效合成的有效性。