One-step integration of multiple genes into the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica
- 作者
- Shuliang Gao, Linna Han, Li Zhu, Mei Ge, Sheng Yang, Yu Jiang, Daijie Chen
- 单位
- College of Bioengineering, East China University of Science and Technology, 130 Meilong Road, Shanghai 200237, China; School of Pharmacology, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China; Shanghai Laiyi Center for Biopharmaceutical R&D, 800 Dongchuan Road, Shanghai 200240, China; CAS Key Laboratory of Synthetic Biology, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 300 Fenglin Road, Shanghai 200032, China; Shanghai Research and Development Center of Industrial Biotechnology, 528 Ruijing Road, Shanghai 201201, China; Huzhou Research Center of Industrial Biotechnology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Huzhou 313000, China; Shanghai Collaborative Innovation Center for Biomanufacturing Technology, 130 Meilong Road, Shanghai 200237, China; Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, 1320 West Beijing Road, Shanghai 200040, China
- 杂志
- Biotechnology Letters（2014）
- DOI
- 10.1007/s10529-014-1634-y
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解脂耶氏酵母中多基因生化途径的整合通常需要逐次进行，每个基因耗时一周，缺乏一步整合多个基因的快速方法，限制其代谢工程和合成生物学应用。
研究策略
利用DNA assembler方法，通过体内同源重组将多个基因表达盒与rDNA同源臂组装并一步整合到解脂耶氏酵母染色体rDNA位点，以β-胡萝卜素生物合成途径（约11 kb，四个基因）作为概念验证。
研究路线图
核心内容
该研究报道了一种基于DNA assembler方法的多基因一步整合策略，用于在解脂耶氏酵母中快速组装并整合完整的β-胡萝卜素生物合成途径。研究者将约11 kb、包含四个基因的途径表达盒与rDNA同源臂通过体内同源重组一步整合到染色体rDNA位点，以替代传统的逐基因顺序整合方式。结果表明，该方法的途径组装整合效率最高可达约21%，正确组装率在60%至70%之间；所得最高产菌株CIBTS1176的β-胡萝卜素产量达到2.22±0.34 mg/g DCW，而另一途径构型代表菌株CIBTS1187产量为0.84±0.05 mg/g DCW。整个流程在不到一周内完成，而传统方法整合n个基因需要n周时间。该工作首次在解脂耶氏酵母中实现了包含四个基因的完整途径的一步整合，显著缩短了多基因代谢工程的操作周期，为该酵母在合成生物学和功能基因组学研究中的应用提供了高效、省时的工具。
创新点
首次在解脂耶氏酵母中实现包含四个基因的完整β-胡萝卜素生物合成途径（约11 kb）的一步整合；将多基因整合时间从n周（n个基因）缩短至不到一周。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica ATCC 201249 | β-胡萝卜素生物合成途径 | GGS1 | — | 催化 | 来自Yarrowia lipolytica，编码香叶基香叶基焦磷酸合酶 |
| Yarrowia lipolytica ATCC 201249 | β-胡萝卜素生物合成途径 | carB | — | 催化 | 来自Mucor circinelloides，编码八氢番茄红素脱氢酶 |
| Yarrowia lipolytica ATCC 201249 | β-胡萝卜素生物合成途径 | carRP | — | 催化 | 来自Mucor circinelloides，编码番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶双功能酶 |
| Yarrowia lipolytica ATCC 201249 | β-胡萝卜素生物合成途径 | crtE | — | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，编码香叶基香叶基焦磷酸合酶 |
| Yarrowia lipolytica ATCC 201249 | β-胡萝卜素生物合成途径 | crtI | — | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，编码八氢番茄红素脱氢酶 |
| Yarrowia lipolytica ATCC 201249 | β-胡萝卜素生物合成途径 | crtYB | — | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，编码八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶双功能酶 |
| Yarrowia lipolytica ATCC 201249 | β-胡萝卜素生物合成途径 | ura3 | — | 催化 | 来自Yarrowia lipolytica，作为选择标记 |
关键发现
- MC途径一步组装整合效率为20.9%（摘要报道最高21%），XD途径为11.7%
- 正确组装率MC为60%、XD为70%
- 最高产菌株CIBTS1176的β-胡萝卜素产量为2.22±0.34 mg/g DCW（摘要为2.2±0.3 mg/g DCW）
- XD途径代表菌株CIBTS1187产量为0.84±0.05 mg/g DCW
- 整合途径大小为约11 kb，由四个基因组成
- 整个流程在不到一周内完成，而传统顺序整合方法需n周整合n个基因。
研究结论
开发的DNA assembler方法在解脂耶氏酵母中实现了多基因一步整合，显著节省时间，为合成生物学、代谢工程及功能基因组学研究提供了高效工具。