Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae using endogenous xylose-assimilating genes
- 作者
- Jin Konishi, Akira Fukuda, Kozue Mutaguchi, Takeshi Uemura
- 杂志
- Biotechnology Letters（2015）
- DOI
- 10.1007/s10529-015-1840-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母不能天然发酵木糖，需要构建能够高效利用葡萄糖/木糖混合物生产乙醇的工程菌株，同时避免外源基因带来的法规和商业限制。
研究策略
利用酿酒酵母内源木糖同化基因GRE3、SOR1和XKS1，以PGK1启动子和终止子构建表达盒，整合至实验室菌株CEN.PK2-1C和工业菌株Kyokai No.7的AUR1位点，并与整合树干毕赤酵母（Scheffersomyces stipitis）的SsXYL1/SsXYL2的工程菌进行比较。
核心内容
该研究利用酿酒酵母自身的内源木糖同化基因GRE3、SOR1和XKS1，通过PGK1启动子和终止子构建表达盒，整合至实验室菌株CEN.PK2-1C和工业菌株Kyokai No.7的AUR1位点，构建无需外源基因的自克隆木糖发酵菌株，并与整合树干毕赤酵母SsXYL1/SsXYL2的异源工程菌进行比较。酶活测定显示内源GRE3比酶活为0.35 U/mg，明显高于SsXYL1的0.06，而SOR1活性接近SsXYL2。以50 g/L木糖为唯一碳源时，工业菌株背景的K7-XYL在47小时内完全消耗木糖，乙醇产量12.2 g/L，得率46.3%；实验室菌株CEN-XYL仅消耗45%木糖。在葡萄糖与木糖混合条件下，K7-XYL的木糖消耗速率是CEN-XYL的1.8倍，且显著优于异源菌株K7-SsXYL（1.5 g/h对0.73 g/h，72小时仅消耗48%），乙醇产量达37.6 g/L，同时避免乙酸积累。增加通气量可将木糖消耗速率从0.87提升至1.47 g/L/h，木糖醇产量降低56%。研究表明利用内源基因构建自克隆工业菌株具有实际应用潜力，通氧优化可缓解辅因子不平衡问题。
创新点
采用酿酒酵母自身的内源基因而非异源基因构建自克隆菌株，更利于工业应用；系统比较了实验室菌株与工业菌株的木糖发酵性能；发现通氧条件优化可以缓解辅因子不平衡导致的木糖醇积累。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 木糖代谢 | — | — | 催化 | 实验室菌株，整合内源木糖同化基因盒（GRE3-SOR1-XKS1），构建CEN-XYL |
| Saccharomyces cerevisiae Kyokai No.7 | 木糖代谢 | — | — | 催化 | 工业菌株，整合内源基因盒构建K7-XYL，表现出更高的木糖消耗速率和乙醇产量 |
| — | 木糖还原/氧化途径（XR-XDH） | GRE3 | 醛糖还原酶 | 催化 | 酿酒酵母内源木糖还原酶，催化木糖→木糖醇，偏好NADPH |
| — | 木糖还原/氧化途径（XR-XDH） | SOR1 | 山梨醇脱氢酶 | 催化 | 酿酒酵母内源木糖醇脱氢酶，催化木糖醇→木酮糖，使用NAD+ |
| — | 木糖代谢下游 | XKS1 | 木酮糖激酶 | 催化 | 催化木酮糖→木酮糖-5-磷酸，进入戊糖磷酸途径 |
| — | 木糖还原/氧化途径（XR-XDH） | SsXYL1 | 木糖还原酶（来自Scheffersomyces stipitis） | 催化 | 异源对照，可利用NADH和NADPH |
| — | 木糖还原/氧化途径（XR-XDH） | SsXYL2 | 木糖醇脱氢酶（来自Scheffersomyces stipitis） | 催化 | 异源对照，用于构建K7-SsXYL |
| — | 木糖还原/氧化途径（XR-XDH） | ScXYL2 | 木糖醇脱氢酶同源蛋白 | 催化 | 活性极低，未用于工程菌构建 |
关键发现
- 内源GRE3比酶活为0.35 U/mg蛋白，高于SsXYL1的0.06
- SOR1比酶活为2.1，接近SsXYL2的2.8，而ScXYL2仅0.21，几乎无活性。以50 g/L木糖为唯一碳源时，工程菌K7-XYL（工业菌Kyokai No.7背景）47 h内完全消耗木糖，乙醇产量12.2 g/L，乙醇得率46.3%
- 而实验室菌株CEN-XYL仅消耗45%，乙醇7.1 g/L，木糖醇4.3 g/L。在含80 g/L葡萄糖和50 g/L木糖的SC培养基中，K7-XYL的木糖消耗速率是CEN-XYL的1.8倍，乙醇得率（按初始糖计）为63.8%（CEN-XYL为58.5%），糖消耗速率1.03 g/L/h。在含70 g/L葡萄糖和50 g/L木糖的CBS培养基中，K7-XYL的木糖消耗速率为1.5 g/h，48 h耗尽，乙醇产量37.6 g/L
- 而K7-SsXYL（异源XR/XDH）木糖消耗速率仅0.73 g/h，72 h只消耗48%，乙醇32 g/L，并积累乙酸5.31 g/L。增加通气量（工作体积15 mL比30 mL）可使K7-XYL的木糖消耗速率从0.87 g/L/h提高到1.47 g/L/h，木糖醇产量降低56%。
研究结论
利用酿酒酵母内源基因GRE3、SOR1和XKS1构建的工程菌（尤其是工业菌株Kyokai No.7背景）表现出足够的木糖发酵能力，可用于葡萄糖/木糖混合物的高效乙醇生产，通过优化通氧可以进一步改善辅因子平衡，减少副产物。