Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae and in silico investigation for enhanced 2,3-butanediol production

作者: Chelladurai Rathnasingh, Jong Myoung Park, Duk-ki Kim, Hyohak Song, Yong Keun Chang
单位: Research and Development Center, GS Caltex Corporation; BioSystem Engineering Laboratory, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST
杂志: Biotechnology Letters（2016）
DOI: 10.1007/s10529-016-2062-y
所属领域: 代谢工程
关键词: 2,3-ButanediolAcetate kinaseAlcohol dehydrogenaseIn silico investigationKlebsiella pneumoniaeLactate dehydrogenasePhosphotransacetylase
阅读原文: 查看 PDF 原文

解决的核心问题

肺炎克雷伯氏菌发酵生产2,3-丁二醇时副产物多、产率低，需要代谢工程改造减少副产物、提高2,3-丁二醇的产量、产率与生产强度。

研究策略

基于基因组规模代谢模型iYL1228进行计算机模拟分析，预测敲除ldhA、adhE和pta-ackA基因的效果，构建基因敲除突变株；通过分批发酵评价各突变株性能，并在补料分批发酵中优化搅拌转速以提高细胞生长和产物生产。

研究路线图

100%

下载 .drawio 源文件

核心内容

本研究以低黏液表型的肺炎克雷伯氏菌KCTC12133BP为底盘，基于基因组规模代谢模型iYL1228进行计算机模拟，预测并系统敲除乳酸（ldhA）、乙醇（adhE）和乙酸（pta-ackA）合成途径的关键基因，以减少副产物积累、提高2,3-丁二醇产量。分批发酵结果显示，单敲除ldhA使产量从野生型的20.9 g/L提高约20%至25.4 g/L；叠加敲除adhE后产量升至31.2 g/L；三基因敲除菌株产量达38.5 g/L，产率0.44 g/g葡萄糖（约为理论产率的88%），乙酸低于2 g/L，2,3-丁二醇占总分泌代谢物的70%以上，但生产强度较低。在补料分批发酵中，将搅拌转速优化至350 rpm后，该菌株实现91 g/L的2,3-丁二醇产量，产率0.45 g/g葡萄糖，生产强度达1.62 g/L/h；转速提高至450 rpm时反而因乙酸和乙偶姻积累导致产量下降至83.4 g/L。研究证明计算机模拟指导的多基因敲除结合搅拌转速优化可有效实现副产物削减与高产，为肺炎克雷伯氏菌工业化生产2,3-丁二醇提供了可行策略。

创新点

利用in silico模拟指导多基因敲除，系统性消除乳酸、乙醇和乙酸合成途径；使用低黏液表型的K. pneumoniae KCTC12133BP菌株；发现搅拌转速对细胞生长和2,3-丁二醇产量的显著影响并优化至350 rpm。

研究对象（3）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Klebsiella pneumoniae KCTC12133BP	乳酸合成	ldhA	乳酸脱氢酶	催化	敲除以减少乳酸副产物
Klebsiella pneumoniae KCTC12133BP	乙醇合成	adhE	乙醇脱氢酶	催化	敲除以减少乙醇副产物
Klebsiella pneumoniae KCTC12133BP	乙酸合成	pta-ackA	磷酸转乙酰酶/乙酸激酶	催化	敲除pta-ackA以减少乙酸副产物

关键发现

野生型K. pneumoniae分批发酵产生20.9 g/L 2,3-丁二醇，产率0.26 g/g葡萄糖，生产强度1.44 g/L/h
ΔldhA突变株产量25.4 g/L、产率0.31 g/g、生产强度1.51 g/L/h，产量提高约20%
ΔldhA ΔadhE突变株产量31.2 g/L、产率0.39 g/g
ΔldhA ΔadhE Δpta-ackA三敲除菌株在分批发酵中产量达38.5 g/L，产率0.44 g/g（为理论产率的88%），乙酸低于2 g/L，2,3-丁二醇占总分泌代谢物的70%以上，但生产强度仅0.53 g/L/h
在补料分批发酵中，350 rpm搅拌速度下达到91 g/L 2,3-丁二醇，产率0.45 g/g葡萄糖，生产强度1.62 g/L/h
450 rpm时因乙酸和乙偶姻积累，产量降至83.4 g/L。

研究结论

通过系统敲除ldhA、adhE和pta-ackA基因并结合搅拌转速优化，获得了高产2,3-丁二醇的肺炎克雷伯氏菌工程菌株，在补料分批发酵中实现91 g/L产量、0.45 g/g产率和1.62 g/L/h生产强度，为工业应用提供了潜力。