Characterization of an ene-reductase from Meyerozyma guilliermondii for asymmetric bioreduction of α,β-unsaturated compounds
- 作者
- Baoqi Zhang, Liandan Zheng, Jinping Lin, Dongzhi Wei
- 杂志
- Biotechnology Letters（2016）
- DOI
- 10.1007/s10529-016-2124-1
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
从Meyerozyma guilliermondii中发现并表征一种新型烯还原酶（MgER），解决现有烯还原酶活性低、底物耐受性差、立体选择性不足等问题，实现α,β-不饱和化合物的高效不对称还原。
研究策略
基于序列同源性的基因组挖掘，克隆MgER基因并在E. coli中异源表达，纯化后进行酶学性质表征、底物谱和立体选择性分析，并偶联GDH再生NADPH进行(R)-香芹酮的生物转化。
核心内容
该研究从酵母Meyerozyma guilliermondii ATCC6260中通过序列同源性基因组挖掘发现了一种新型烯还原酶MgER，将其基因克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达。纯化后的MgER以FMN为辅基，偏好NADPH作为辅因子，对(R)-香芹酮的比活力为1.67 U/mg，远高于NADH时的0.02 U/mg。酶学性质表征显示其最适反应条件为30°C和pH 7，对N-苯基马来酰亚胺表现出最高活力（10.16 U/mg），且在不同温度下稳定性良好。底物谱分析表明MgER对多种α,β-不饱和化合物具有还原活性，尤其对(R)-香芹酮和酮异佛尔酮表现出大于99%的立体选择性。在偶联葡萄糖脱氢酶再生NADPH的体系中，150 mM高浓度(R)-香芹酮经22小时反应可完全转化，产率达98.9%，光学纯度超过99% d.e.。这一结果显著优于多数已报道烯还原酶通常低于10 mM的底物耐受性，表明MgER在高底物负载下兼具优异立体选择性和实用稳定性，为(2R,5R)-二氢香芹酮等手性化合物的高效制备提供了有应用潜力的新酶资源。
创新点
1. 首次报道来自M. guilliermondii的烯还原酶MgER；2. MgER对(R)-香芹酮还原具有>99% d.e.的优异立体选择性，且底物负载高达150 mM（远高于多数报道的<10 mM）；3. 实现了98.9%产率、>99% d.e.的(2R,5R)-二氢香芹酮合成，展示出实际应用潜力。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Meyerozyma guilliermondii ATCC6260 | 烯还原 | ene-reductase gene (XM_001481950) | MgER | 催化 | 基因来源菌株；MgER为NADPH依赖的烯还原酶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达 | pET28a(+)-MgER | MgER | 催化 | 异源表达宿主，用于重组蛋白生产 |
| — | NADPH再生 | gdh | 葡萄糖脱氢酶 (GDH) | 催化 | 用于NADPH辅因子再生 |
关键发现
- MgER与OYE2.6氨基酸一致性57%
- 最适条件为30°C、pH 7（100 mM磷酸钠缓冲液）
- 以NADPH为辅因子（对(R)-香芹酮比活1.67 U/mg，NADH仅0.02 U/mg）
- 含FMN辅基
- 对N-苯基马来酰亚胺比活最高10.16 U/mg
- 对(R)-香芹酮和酮异佛尔酮的还原立体选择性>99% d.e./e.e.
- 在30°C、pH 7下，150 mM (R)-香芹酮经22 h完全转化，产率98.9%，光学纯度>99% d.e.
- 酶在pH 7下4°C半衰期180 h，30°C半衰期100 h，40°C半衰期60 h。
研究结论
MgER是一种来自酵母的新型烯还原酶，具有高立体选择性、高底物耐受性和良好的稳定性，在α,β-不饱和化合物的不对称还原中具有重要应用潜力，尤其可用于高效制备(2R,5R)-二氢香芹酮。