Identification and Characterization of a Novel Monoterpene Synthase from Soybean Restricted to Neryl Diphosphate Precursor
- 作者
- Man Zhang, Jianyu Liu, Kai Li, Deyue Yu
- 单位
- National Center for Soybean Improvement, National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu, China; Institute of Vegetable Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing, Jiangsu, China
- 杂志
- PLoS ONE（2013）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0075972
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从大豆中克隆并鉴定一个新型单萜合酶基因GmNES，该酶特异利用橙花基二磷酸（NPP）而非香叶基二磷酸（GPP）合成单萜橙花醛，并探究其在植物防御中的生态功能。
研究策略
利用EST筛选和RACE技术克隆全长cDNA；通过序列比对和系统发育分析确定其属于TPS-g亚家族；采用实时定量PCR分析表达模式；在大肠杆菌中表达重组蛋白并利用GC-MS检测酶产物；用GFP融合蛋白确定亚细胞定位；在烟草中过表达GmNES并开展棉铃虫行为及生长实验。
核心内容
该研究从大豆中克隆并鉴定了一个新型单萜合酶基因GmNES，编码565个氨基酸的蛋白，定位于叶绿体。通过大肠杆菌表达重组蛋白并结合GC-MS检测，发现该酶特异性地以橙花基二磷酸（NPP）为底物催化合成橙花醛，而对香叶基二磷酸（GPP）和法尼基二磷酸（FPP）无活性，这一底物专一性支持了NPP可作为单萜合酶底物的新观点。表达模式分析显示，GmNES受水杨酸处理、机械损伤及棉铃虫取食诱导表达，提示其参与植物诱导防御。在烟草中过表达GmNES可释放橙花醛，双选实验中12小时后8只棉铃虫幼虫选择野生型植株而仅4只选择转基因植株，且幼虫在转基因植株上体重增长显著降低，表明橙花醛具有驱避和抑制害虫生长的功能。该研究首次在大豆中鉴定出以NPP为底物的单萜合酶，为理解植物萜类防御机制提供了新线索，也为利用代谢工程改良作物抗虫性提供了潜在靶标。
创新点
首次在大豆中鉴定并表征单萜合酶GmNES；证明该酶专一利用NPP而非GPP作为底物，支持了NPP作为单萜合酶底物的新观点；发现其催化产物橙花醛对棉铃虫有驱避和生长发育抑制作用，为代谢工程改良作物抗虫性提供了新靶标。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌（E. coli BL21-AI） | 单萜生物合成 | GmNES | GmNES蛋白 | 催化 | 体外重组表达，以NPP为底物催化生成橙花醛，对GPP和FPP无活性 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Samsun） | 单萜生物合成 | GmNES | GmNES蛋白 | 催化 | 过量表达GmNES，植株可释放橙花醛，能驱避棉铃虫并抑制其生长 |
| 大豆（Glycine max cv. Bogao） | 单萜生物合成 | GmNES | GmNES蛋白 | 催化 | 内源基因，受SA、机械损伤及棉铃虫取食诱导表达，蛋白定位于叶绿体 |
关键发现
- GmNES基因编码565个氨基酸的蛋白，分子量66 kDa，pI 5.6
- 基因位于大豆第13号染色体，含6个外显子和5个内含子，全长3.7 kb。表达分析显示，SA处理6 h后转录显著积累，机械损伤4 h诱导、8 h达峰，棉铃虫取食12 h诱导。重组GmNES仅以NPP为底物产生橙花醛，对GPP和FPP无活性。转基因烟草释放橙花醛
- 双选实验中12 h后8只幼虫选择野生型、4只选择转基因植株（p<0.01）
- 饲喂实验显示幼虫在转基因植株上体重增长显著降低（120 h后，p<0.05）。
研究结论
研究确认GmNES是一个特异以NPP为底物、定位于叶绿体的单萜合酶，其产物橙花醛具有驱避和抑制棉铃虫生长的生物学功能，为理解植物萜类防御机制和利用代谢工程改良作物抗虫性提供了理论依据。