Engineering a glycerol utilization pathway in Corynebacterium glutamicum for succinate production under O2 deprivation

作者: Chen Wang, Heng Cai, Zhongjun Chen, Zhihui Zhou
单位: College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University; College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University
杂志: Biotechnology Letters（2017）
DOI: 10.1007/s10529-016-2166-4
所属领域: 代谢工程
关键词: Corynebacterium glutamicumGlycerol utilizationNADH generationSuccinate production
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解决的核心问题

谷氨酸棒杆菌缺乏甘油代谢途径，无法利用甘油在氧剥夺条件下高效生产琥珀酸。

研究策略

将大肠杆菌K-12的甘油利用途径基因（glpF、gldA、dhaKLM）异源表达于谷氨酸棒杆菌，构建甘油利用途径，通过NADH再生增强琥珀酸生产。

研究路线图

100%

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核心内容

为赋予谷氨酸棒杆菌利用甘油生产琥珀酸的能力，研究者将大肠杆菌K-12的甘油利用途径基因glpF、gldA和dhaKLM异源表达于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中，构建了重组菌NC-3G。酶活测定显示该菌株成功表达甘油脱氢酶（比活1.3 U/mg）和二羟丙酮激酶（比活2.1 U/mg）。在氧剥夺条件下以甘油为唯一碳源发酵，琥珀酸产量达19.2 g/l，产率高达1.02 g/g；而以葡萄糖为碳源时虽然产量略高（22.5 g/l），但产率仅0.80 g/g。添加200 mM NaHCO₃后，甘油消耗速率从0.31 g/l·h提升至1.02 g/l·h，琥珀酸产量提高3.5倍。补料分批发酵共消耗37.6 g/l甘油，产生38.4 g/l琥珀酸，平均产率达1.02 g/g，达到理论最大产率的80%。该研究首次在谷氨酸棒杆菌中构建厌氧甘油利用途径，证明甘油代谢产生的额外NADH有利于还原产物琥珀酸的合成，为利用廉价甘油原料进行琥珀酸生物制造提供了可行方案。

创新点

首次在谷氨酸棒杆菌中构建厌氧甘油利用途径用于琥珀酸生产；以甘油为唯一碳源在氧剥夺条件下实现高效琥珀酸合成。

研究对象（4）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032	甘油利用途径	glpF	GlpF	转运	来自大肠杆菌K-12的甘油协助扩散蛋白，整合至染色体，介导甘油跨膜转运
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032	甘油利用途径	gldA	GldA	催化	来自大肠杆菌K-12的甘油脱氢酶，催化甘油氧化为二羟丙酮并生成NADH
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032	甘油利用途径	dhaKLM	DhaK/DhaL/DhaM	催化	来自大肠杆菌K-12的二羟丙酮激酶，磷酸化二羟丙酮为磷酸二羟丙酮
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032	琥珀酸合成回补途径	—	PEPC/PC	催化	磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶/丙酮酸羧化酶，固定CO2生成草酰乙酸，促进琥珀酸合成

关键发现

重组菌NC-3G成功表达甘油脱氢酶（比活1.3 U/mg）和二羟丙酮激酶（比活2.1 U/mg）。以甘油为唯一碳源时，琥珀酸产量19.2 g/l，乙酸3.1 g/l，丙酮酸1.2 g/l，产率1.02 g/g，NADH/NAD+比为0.95
而以葡萄糖为碳源时，琥珀酸产量22.5 g/l，乙酸4.2 g/l，丙酮酸2.5 g/l，产率0.80 g/g，NADH/NAD+比为0.64。添加200 mM NaHCO3后，甘油消耗速率从0.31 g/l.h提高到1.02 g/l.h，琥珀酸产率从0.91提高到1.01 g/g，琥珀酸产量提高3.5倍。补料分批发酵中，消耗37.6 g/l甘油，产生38.4 g/l琥珀酸，平均产率1.02 g/g，达到理论最大产率的80%，副产物丙酮酸2.4 g/l、乙酸3.9 g/l。甘油利用的琥珀酸生产速率为0.8 g/l.h，而葡萄糖为1.7 g/l.h。

研究结论

代谢工程改造的谷氨酸棒杆菌NC-3G能在氧剥夺条件下以甘油为唯一碳源高效生产琥珀酸。甘油代谢产生更多NADH，有利于还原产物琥珀酸的生成，且琥珀酸产量和生产率高于已有报道。