Production of \(\beta\) -carotene by expressing a heterologous multifunctional carotene synthase in Yarrowia lipolytica
- 作者
- Shuliang Gao, Yangyang Tong, Li Zhu, Mei Ge, Yu Jiang, Daijie Chen, Sheng Yang
- 单位
- East China University of Science and Technology; Shanghai Normal University; Shanghai Laiyi Center for Biopharmaceutical R&D; Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences; Shanghai Research and Development Center of Industrial Biotechnology; Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; Jiangsu National Synergetic Innovation Center for Advanced Materials (SICAM)
- 杂志
- Biotechnology Letters（2017）
- DOI
- 10.1007/s10529-017-2318-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在解脂耶氏酵母中异源表达一个具有植烯合酶、植烯脱氢酶和番茄红素β-环化酶三种活性的多功能类胡萝卜素合酶（carS），以实现β-胡萝卜素的从头合成；同时提高DNA组装整合效率。
研究策略
利用DNA assembler方法，将来自Schizochytrium sp.的多功能carS基因与GGS1表达盒整合到解脂耶氏酵母染色体中；通过敲除ku70和ku80降低非同源末端连接（NHEJ）效率，提高DNA组装效率。
研究路线图
核心内容
本研究在解脂耶氏酵母中实现β-胡萝卜素的从头合成。研究者利用DNA assembler方法，将来自Schizochytrium sp.的多功能类胡萝卜素合酶基因carS（全长3807 bp，编码1268个氨基酸，含植烯合酶、植烯脱氢酶及番茄红素β-环化酶三个保守结构域）与香叶基香叶基二磷酸合酶基因GGS1共同整合至酵母染色体。为提升组装效率，通过CRISPR-Cas9敲除ku70和ku80以抑制非同源末端连接，使DNA组装效率较野生型提高13.4倍，最高达63%。最终重组菌株β-胡萝卜素产量为0.41 mg/g细胞干重，而野生型未检出该产物。结果表明，多功能carS可在解脂耶氏酵母中功能性表达并驱动β-胡萝卜素合成，同时ku70/ku80敲除策略显著增强了多基因片段整合效率，为在非常规酵母中高效构建复杂生物合成途径提供了可行工具。
创新点
首次在解脂耶氏酵母中功能性表达含三种催化活性的多功能carotene synthase；利用CRISPR-Cas9敲除ku70/ku80显著提高DNA组装效率，较野生型提高13.4倍。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica | β-胡萝卜素生物合成 | carS | 多功能类胡萝卜素合酶（含植烯合酶、植烯脱氢酶、番茄红素β-环化酶活性） | 催化 | 来自Schizochytrium sp.，GenBank: DD253524.1，3807 bp，编码1268氨基酸 |
| Yarrowia lipolytica | 类异戊二烯/β-胡萝卜素生物合成 | GGS1 | 香叶基香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 催化FPP转化为GGPP，为β-胡萝卜素合成提供前体 |
| Yarrowia lipolytica | - | ku70 | Ku70蛋白 | 调控 | 敲除后降低NHEJ，提高同源重组效率 |
| Yarrowia lipolytica | - | ku80 | Ku80蛋白 | 调控 | 敲除后降低NHEJ，提高同源重组效率 |
关键发现
在Δku70Δku80菌株中，DNA组装效率为56.2±6.3%（8/16, 10/16, 9/16），较野生型（4.2±7.2%，2/16, 0/16, 0/9）提高13.4倍，最高效率达到63%（10/16）。重组解脂耶氏酵母最高产量为0.41 mg β-胡萝卜素/g细胞干重，野生型未检测到β-胡萝卜素。carS基因全长3807 bp，编码1268个氨基酸，含植烯合酶（587-861 aa）、植烯脱氢酶（55-547 aa）和番茄红素β-环化酶（910-1004和1051-1141 aa）三个保守结构域。
研究结论
通过在解脂耶氏酵母中表达来自Schizochytrium sp.的GGS1和多功能carotene synthase，成功实现了β-胡萝卜素的合成；敲除ku70和ku80可大幅提高DNA组装效率，为高效构建生物合成途径提供了新工具。