Loss of function of the carbon catabolite repressor CreA leads to low but inducer-independent expression from the feruloyl esterase B promoter in Aspergillus niger
- 作者
- Jos Reijngoud, Mark Arentshorst, Claudine Ruijmbeek, Ian Reid, Ebru Demirci Alazi, Peter J. Punt, Adrian Tsang, Arthur F. J. Ram
- 单位
- 荷兰莱顿大学生物学研究所分子微生物学与生物技术系; 加拿大康考迪亚大学结构和功能基因组学中心; 荷兰Dutch DNA Biotech
- 杂志
- Biotechnology Letters（2021）
- DOI
- 10.1007/s10529-021-03104-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析黑曲霉中阿魏酸酯酶B（faeB）启动子转录调控的分子机制，筛选导致faeB启动子不依赖诱导物而组成型表达的调控因子。
研究策略
构建PfaeB-amdS和PfaeB-lux双报告菌株，通过UV诱变在非诱导碳源D-果糖上筛选组成型表达突变体；结合全基因组测序、烯丙醇敏感性分析、creA基因重测序及靶向敲除验证CreA（碳分解代谢物阻遏蛋白）的功能。
研究路线图
核心内容
本研究通过构建携带PfaeB-amdS和PfaeB-lux双报告系统的黑曲霉菌株，在非诱导碳源D-果糖上经UV诱变正向筛选不依赖诱导物而组成型激活faeB启动子的突变体，并借助全基因组测序、烯丙醇敏感性分析及靶向基因敲除，鉴定了关键调控因子。共获得111个trans-acting突变体，其中107个对烯丙醇敏感；对32个此类突变体的creA基因测序发现27个携带突变，且25个集中于C2H2锌指DNA结合结构域，L113STOP和R117C高频出现。敲除creA后，非诱导条件下荧光素酶活性提升约8倍（从约400 cps升至约3200 cps），诱导条件下提升约4倍，且启动子序列含14个推定CreA结合位点。结果表明，CreA功能缺失可使faeB启动子产生低水平但组成型的表达，强诱导物仍可进一步增强表达，这为通过操控转录因子提升阿魏酸酯酶产量提供了可行的代谢工程策略。
创新点
首次证明CreA功能缺失可导致faeB启动子在无芳香诱导物条件下产生低水平但组成型的表达；通过正向遗传筛选发现大量CreA突变体，并揭示其突变主要富集在C2H2锌指DNA结合结构域。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus niger | 阿魏酸酯代谢/芳香族化合物代谢 | faeB | FaeB（阿魏酸酯酶B） | 催化 | 目标基因，其启动子受CreA阻遏并被芳香酸（如阿魏酸、咖啡酸、对香豆酸）诱导 |
| Aspergillus niger | 碳代谢物阻遏 | creA | CreA（碳分解代谢物阻遏蛋白） | 调控 | C2H2锌指转录抑制因子，其功能缺失导致faeB启动子组成型低表达 |
| Aspergillus niger | 氮代谢（报告系统） | amdS | AmdS（乙酰胺酶） | 催化 | 报告基因，用于筛选faeB启动子组成型表达，以乙酰胺为唯一氮源时生长作为表型 |
| Aspergillus niger | 发光报告系统 | lux | Luciferase（荧光素酶） | 催化 | 报告基因，定量检测faeB启动子活性，用于确认trans-acting突变 |
关键发现
- 共分离到111个trans-acting突变体（13个来自JR10.2背景，98个来自JR11.1背景），其中除4个外（107个）均对烯丙醇敏感
- 对32个烯丙醇敏感突变体的creA基因测序发现27个携带creA突变，其中25个突变位于DNA结合域（7个在第一C2H2基序，15个在第二C2H2基序），L113STOP出现6次、R117C出现4次
- 靶向敲除creA导致非诱导条件下荧光素酶活性提高约8倍（约400 cps升至约3200 cps），在诱导物存在时约4倍
- trans-acting突变体在非诱导条件下发光值比亲本高4-10倍（如JR11.1 U#73约2500 cps vs 亲本约400 cps），诱导条件下高3-5倍（约35000 cps vs 10000 cps）
- PfaeB-lux报告菌株在0.05%阿魏酸诱导下约12000 cps，非诱导条件下约500 cps
- faeB启动子含14个推定CreA结合位点（5'-SYGGRG-3'）。
研究结论
黑曲霉中CreA功能缺失导致faeB启动子在D-果糖上无诱导物时低水平组成型表达，而强诱导物（如阿魏酸）可进一步提高表达；这为通过调控转录因子提高阿魏酸酯酶产量提供了理论依据。