Production of D-glucaric acid with phosphoglucose isomerase-deficient Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Mervi Toivari, Maija-Leena Vehkomäki, Laura Ruohonen, Merja Penttilä, Marilyn G. Wiebe
- 杂志
- Biotechnology Letters（2023）
- DOI
- 10.1007/s10529-023-03443-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在酿酒酵母中，D-葡萄糖向D-葡糖二酸转化时糖酵解通量过强，导致产率低；同时Pgi1p缺陷型菌株对葡萄糖的耐受性差，需要设计合适的补料策略。
研究策略
将D-葡糖二酸生物合成途径（INO1、Miox、uro1，以及INM1）引入磷酸葡萄糖异构酶（Pgi1p）缺陷型酿酒酵母菌株，阻断糖酵解使葡萄糖-6-磷酸积累并导向肌醇途径；通过脉冲补料D-果糖/乙醇、限制氮源、使用聚合底物（商业多糖、纤维素）等方式降低葡萄糖毒性并提高产率。
研究路线图
核心内容
该研究在磷酸葡萄糖异构酶（Pgi1p）缺陷型酿酒酵母中引入由INO1、Miox、uro1和INM1构成的D-葡糖二酸生物合成途径，通过阻断糖酵解使葡萄糖-6-磷酸积累并导向肌醇途径，同时采用脉冲补料D-果糖/乙醇、限制氮源及聚合底物等策略缓解葡萄糖毒性。关键结果表明，在生物反应器中脉冲补料D-果糖和乙醇时D-葡糖二酸产量为1.3 g/L，产率0.12 g/g；氮限制条件下滴度0.71 g/L，产率达0.23 g/g，约为Gupta等2016年报道的7倍。摇瓶培养中H4344菌株98小时产240 mg/L D-葡糖二酸并积累370 mg/L肌醇，13C标记实验证实了葡萄糖到葡糖二酸的转化，且细胞内D-葡糖二酸浓度维持在10 mg/g生物量。使用商业多糖时H4346和H4351分别产0.79和0.51 g/L，α-纤维素时产量约0.32-0.35 g/L。该研究首次在Pgi1p缺陷型菌株中实现D-葡糖二酸合成，证明阻断糖酵解可有效引导碳流至目标产物，结合过程优化具有进一步提高产量的潜力。
创新点
首次在Pgi1p缺陷型酿酒酵母中实现D-葡糖二酸合成；利用Pgi1p缺失使葡萄糖-6-磷酸积累以提高D-葡糖二酸产率；通过13C标记葡萄糖验证了D-葡萄糖到D-葡糖二酸的转化；在氮限制条件下获得高产率0.23 g/g。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (pgi1Δ) | 糖酵解 | PGI1 | Pgi1p | 调控 | 敲除以减少葡萄糖流向糖酵解，使葡萄糖-6-磷酸积累 |
| Saccharomyces cerevisiae (pgi1Δ) | D-葡糖二酸生物合成途径 | INO1 | Ino1p | 催化 | 肌醇-1-磷酸合酶，催化葡萄糖-6-磷酸转化为1L-肌醇-1-磷酸 |
| Saccharomyces cerevisiae (pgi1Δ) | D-葡糖二酸生物合成途径 | INM1 | Inm1p | 催化 | 肌醇-1-磷酸磷酸酶，催化1L-肌醇-1-磷酸脱磷酸生成肌醇 |
| Saccharomyces cerevisiae (pgi1Δ) | D-葡糖二酸生物合成途径 | Miox | MIOX | 催化 | 来自小鼠的肌醇加氧酶，催化肌醇氧化为D-葡糖醛酸 |
| Saccharomyces cerevisiae (pgi1Δ) | D-葡糖二酸生物合成途径 | uro1 | Udh | 催化 | 来自根癌农杆菌的糖醛酸脱氢酶，催化D-葡糖醛酸转化为D-葡糖二酸 |
关键发现
- 在生物反应器脉冲补料D-果糖和乙醇时，D-葡糖二酸产量为1.3 g/L，产率0.12 g/g
- 氮限制条件下滴度0.71 g/L，产率0.23 g/g（为Gupta等2016年报道的约7倍）
- 摇瓶培养H4344菌株在98 h产240±11 mg/L D-葡糖二酸并积累370±11 mg/L肌醇
- 13C标记实验中检测到280 mg/L标记D-葡糖二酸和330 mg/L标记肌醇
- 细胞内D-葡糖二酸浓度恒定在10±1 mg/g生物量
- 使用商业多糖时H4346和H4351分别产0.79和0.51 g/L D-葡糖二酸，使用α-纤维素时产量约0.32-0.35 g/L。
研究结论
Pgi1p缺陷型酿酒酵母通过阻断糖酵解使碳流有效导向D-葡糖二酸合成，结合其他工程策略及生物过程优化，具有进一步提高产量的潜力。