An RND transporter in the monoterpene metabolism of Castellaniella defragrans
- 作者
- Edinson Puentes-Cala, Jens Harder
- 杂志
- Biodegradation（2018）
- DOI
- 10.1007/s10532-018-9857-6
- 所属领域
- 微生物学
- 关键词
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解决的核心问题
揭示 C. defragrans 中与单萜代谢相关的 RND 外排转运蛋白 AmeABCD 的功能及其在单萜耐受中的作用
研究策略
构建 ameABCD 缺失突变株，结合生长表型实验、Nile Red 荧光积累与外排实验，以及系统发育和蛋白结构预测等生物信息学方法表征该转运复合体
研究路线图
核心内容
该研究通过构建Castellaniella defragrans 65Phen菌株中ameABCD基因簇的缺失突变株，系统表征了该四组分RND外排转运系统在单萜代谢中的功能。实验采用生长表型分析、Nile Red荧光积累与外排抑制实验，并结合系统发育和蛋白结构预测等生物信息学方法。结果显示，ΔameABCD突变株在以柠檬烯、α-萜品烯等非功能化单萜为唯一碳源时生长显著低于野生型，而以10 mM乙酸为碳源时两者无差异；在含3 mM柠檬烯和10 mM乙酸的培养基中突变株生长恢复，但柠檬烯浓度升至5 mM以上时其生长受到明显抑制。Nile Red实验证实该外排系统依赖质子驱动力，2 μM CCCP使细胞积累染料，38.5 μM PAβN可抑制野生型残余外排。AmeD预测含12个跨膜螺旋，与Thauera terpenica同源蛋白一致性达61–80%。研究表明AmeABCD属于HAE3家族新谱系，首次揭示该类四组分系统参与单萜解毒，缺失该转运复合体导致细菌对单萜耐受性显著下降，为理解细菌单萜代谢的耐受机制提供了新视角。
创新点
首次报道 HAE3 家族中一个新型四组分 RND 外排系统 AmeABCD 参与单萜解毒；其亚基组成包含外膜蛋白、两个周质蛋白和内膜泵，类似于 HAE1 型三组分系统，区别于已知的 HAE3 成员
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Castellaniella defragrans 65Phen | 单萜代谢通路 | ameA | AmeA | 转运 | 外膜蛋白，含 N 端信号肽和 DUF1302 结构域，推测为外膜通道蛋白 |
| Castellaniella defragrans 65Phen | 单萜代谢通路 | ameB | AmeB | 转运 | 周质蛋白，属 LoA 超家族（DUF1329），可能作为膜融合蛋白参与复合物组装 |
| Castellaniella defragrans 65Phen | 单萜代谢通路 | ameC | AmeC | 转运 | 周质蛋白，属 COG4447，可能作为装配因子参与 RND 复合体稳定性 |
| Castellaniella defragrans 65Phen | 单萜代谢通路 | ameD | AmeD | 转运 | 内膜 RND 转运蛋白，属 HAE3 家族，含 12 个跨膜螺旋和两个周质环，负责外排单萜 |
关键发现
- ΔameABCD 突变株在柠檬烯、α-萜品烯等非功能化单萜为唯一碳源时生长显著低于野生型
- 以 10 mM 乙酸为唯一碳源时两者生长相似
- 在含 3 mM 柠檬烯和 10 mM 乙酸的培养中，突变株生长恢复。在 DMSO 体系中，当柠檬烯浓度达到 5 mM 时突变株生长仍与野生型相当，更高浓度下显著降低
- 野生型在所有测试浓度下均能生长。Nile Red 积累实验中，2 μM CCCP 使细胞积累染料，ΔameABCD 株积累比野生型略高
- 加入 38.5 μM PAβN 可抑制野生型残余外排。AmeD 与 Thauera terpenica 58EuT 同源蛋白序列一致性为 61-80%。AmeD 预测含 12 个跨膜螺旋及两个周质环。
研究结论
AmeABCD 是一个依赖质子驱动力的四组分 RND 外排泵，属于 HAE3 家族的一个新谱系，在 C. defragrans 中发挥单萜解毒作用，缺失该复合体导致细菌对单萜耐受性显著下降。