Molecular cloning and functional characterization of Catharanthus roseus hydroxymethylbutenyl 4-diphosphate synthase gene promoter from the methyl erythritol phosphate pathway
- 作者
- Olivia Ginis, Vincent Courdavault, Céline Melin, Arnaud Lanoue, Nathalie Giglioli-Guivarc'h, Benoit St-Pierre, Martine Courtois, Audrey Oudin
- 杂志
- Molecular Biology Reports（2011）
- DOI
- 10.1007/s11033-011-1343-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析长春花MEP途径HDS基因启动子的转录调控机制，以理解单萜吲哚生物碱（MIA）生物合成的调控机制。
研究策略
采用TAIL-PCR克隆HDS基因5'侧翼区，构建HDS启动子与GUS报告基因的转录融合载体；通过农杆菌介导转化烟草和基因枪转化长春花C20D细胞，结合5'缺失系列分析和激素处理，研究启动子的组织特异性表达及激素响应性。
核心内容
本研究从长春花中克隆了MEP途径关键基因HDS的上游1049 bp启动子区域，其5'UTR含459 bp内含子。通过构建HDS启动子与GUS报告基因的融合载体，分别转化烟草叶片和长春花C20D细胞，结合5'缺失系列分析发现，全长启动子驱动GUS活性为468 pmol/MU/min/μg，缺失至-902时活性降低50%，缺失至-656时降至25%以下，而缺失至-629和-600则几乎完全丧失活性，据此确定了最小启动子区域及两个可能含增强子的区段。组织化学染色显示GUS表达局限于烟草叶片韧皮部。激素处理实验表明，去除2,4-D、添加玉米素、茉莉酸甲酯或乙烯利均能增强启动子活性及HDS基因表达，其中乙烯诱导在48 h后显著，这是首次报道乙烯对该启动子的诱导作用。此外还预测了Dof和WRKY等激素调控相关顺式元件。这些结果说明HDS启动子含有组织特异性与激素响应性元件，其活性与MIA生物合成诱导条件吻合，提示相关转录因子可能参与MEP途径与单萜环烯醚萜途径的协同调控。
创新点
首次分离并鉴定了长春花MEP途径HDS基因启动子；证明了启动子驱动的GUS表达局限于烟草叶片维管组织（韧皮部）；确定了最小启动子区域及两个可能含增强子的区域；首次报道乙烯对HDS启动子及基因表达的诱导作用；预测了多个参与激素调控的顺式元件（如Dof和WRKY结合位点）。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus C20D细胞系 | MEP途径 | HDS | HMBPP合酶 (HDS) | 催化 | MEP途径关键酶，催化HMBPP合成，其基因启动子是本研究主要对象 |
| 烟草(Nicotiana tabacum)叶片或C. roseus细胞 | 报告基因系统 | GUS | β-葡萄糖醛酸酶 | 催化 | 作为报告基因，用于评估启动子转录活性 |
| Catharanthus roseus | MEP途径调控 | — | Dof转录因子 | 调控 | 推测结合HDS启动子中的DOFCOREZM元件，参与激素和发育调控 |
| Catharanthus roseus | MEP途径调控 | — | WRKY转录因子 | 调控 | 推测结合W-box元件，可能介导茉莉酸甲酯响应 |
关键发现
- 克隆了HDS基因上游1049 bp启动子区域，其5'UTR含一个459 bp内含子。全长启动子（-1049至+26）在瞬时转化中驱动GUS活性为468 pmol/MU/min/μg。5'缺失分析显示：缺失至-902使活性降低50%
- 缺失至-656使活性降至25%以下
- 缺失至-629和-600几乎完全丧失活性。激素处理实验表明，去除2,4-D、添加玉米素（5 μM）、茉莉酸甲酯（100 μM）或乙烯利（0.5 mM）均能增强HDS启动子活性及HDS基因表达（乙烯诱导在48 h后显著）。此外，在pCambia1305载体中，CaMV35S启动子的存在使HDS启动子活性提高2倍，表明其可能干扰启动子功能。
研究结论
长春花HDS启动子含有组织特异性和激素响应性顺式元件，其活性与MIA生物合成诱导条件相关，提示Dof和WRKY等转录因子可能参与MEP途径与单萜环烯醚萜途径的协同调控。