Characterization and functional analysis of the genes encoding 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase and 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, the two enzymes in the MEP pathway, from Amomum villosum Lour
- 作者
- Jinfen Yang, Megha Nath Adhikari, Hui Liu, Hui Xu, Guozhen He, Ruoting Zhan, Jieshu Wei, Weiwen Chen
- 单位
- Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering, Guangzhou University of Chinese Medicine; College of Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine
- 杂志
- Molecular Biology Reports（2012）
- DOI
- 10.1007/s11033-012-1676-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从阳春砂（Amomum villosum）中克隆并功能鉴定MEP途径两个关键酶DXR和DXS的编码基因，为通过代谢工程提高其萜类药用成分含量提供基因资源。
研究策略
利用同源序列设计简并引物结合RACE技术克隆基因；通过生物信息学预测蛋白结构域和信号肽；利用大肠杆菌β-胡萝卜素颜色互补实验验证基因功能；通过半定量RT-PCR分析组织表达模式；通过农杆菌介导法将AvDXR转化烟草，检测过表达后的DXR活性、光合色素含量和挥发性萜类成分。
核心内容
从阳春砂中克隆了MEP途径两个关键酶——1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（AvDXR）和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（AvDXS）的编码基因。AvDXR cDNA全长1749 bp，编码472个氨基酸；AvDXS cDNA全长2347 bp，编码715个氨基酸。序列比对显示两者分别与水稻DXR和油棕DXS具有85%和86%的一致性。通过大肠杆菌β-胡萝卜素颜色互补实验证实两个基因均有功能，转入pTrc-AvDXR或pTrc-AvDXS的菌株β-胡萝卜素积累显著高于空载体对照。组织表达分析表明AvDXR在果实中表达最高，而AvDXS在各组织中无明显差异。将AvDXR转化烟草后，T1代株系D2-1和D2-2的DXR活性显著高于野生型（野生型未检测到活性），其中D2-1和D2-3的总叶绿素和类胡萝卜素含量显著增加，D2-1花释放的挥发性萜类中新增了檀香醇和m-薄荷-4,8-二烯，而野生型仅检测到石竹烯。结果表明AvDXR在异戊二烯生物合成中发挥重要作用，适用于代谢工程改良阳春砂单萜挥发油产量；AvDXS表达模式与挥发油积累无直接关联，可能不是单萜生物合成的主要调控者。
创新点
['首次从姜科植物阳春砂中克隆了AvDXR和AvDXS基因', '通过大肠杆菌颜色互补实验验证了AvDXR和AvDXS的功能', '在烟草中过表达AvDXR显著提高了光合色素含量和挥发性萜类成分']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli TOP10 | MEP途径 | AvDXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR） | 催化 | 催化DXP转化为MEP，是MEP途径的第一个限速步骤 |
| Escherichia coli TOP10 | MEP途径 | AvDXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS） | 催化 | 催化丙酮酸与D-甘油醛-3-磷酸缩合生成DXP |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Zhongyan 90） | MEP途径 | AvDXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR） | 催化 | 过表达AvDXR提高DXR活性、光合色素和挥发性萜类成分 |
关键发现
- AvDXR cDNA全长1749 bp，ORF为1416 bp，编码472个氨基酸，预测分子量51.41 kDa，pI
- 44；AvDXS cDNA全长2347 bp，ORF为2148 bp，编码715个氨基酸，预测分子量77.15 kDa，pI
- 531。AvDXR与水稻DXR（BAB78606）一致性85%、玉米85%、C. stellatopilosus 82%；AvDXS与油棕（AAS99588）一致性86%、蒺藜苜蓿86%、葛根85%、玉米84%。大肠杆菌功能互补实验表明，转入pTrc-AvDXR或pTrc-AvDXS的菌株β-胡萝卜素积累显著高于空载体对照。组织表达分析显示AvDXR在果实（果皮和种子）中表达最高，茎和根次之，叶中最低；AvDXS在各组织中无明显差异。转基因烟草T1代中，株系D2-1和D2-2 DXR活性显著高于野生型（野生型未检测到活性），D2-1和D2-3总叶绿素和类胡萝卜素含量显著增加；D2-1花释放的挥发性萜类中新增了檀香醇和m-薄荷-4,8-二烯，而野生型仅检测到石竹烯。
研究结论
AvDXR在异戊二烯生物合成中发挥重要作用，适用于代谢工程改良阳春砂单萜挥发油产量；AvDXS属于class 1 DXS，其表达模式与挥发油积累无直接关联，可能不是单萜生物合成的主要调控者。