Molecular cloning and characterization of three isoprenyl diphosphate synthase genes from alfalfa
- 作者
- Yan Sun, Ruicai Long, Junmei Kang, Tiejun Zhang, Ze Zhang, He Zhou, Qingchuan Yang
- 杂志
- Molecular Biology Reports（2012）
- DOI
- 10.1007/s11033-012-2262-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
苜蓿中三萜皂苷等萜类生物合成途径的关键酶——异戊烯基二磷酸合酶（IDS）的分子克隆、功能表征及其调控作用尚不清楚，本研究旨在克隆并鉴定了苜蓿中三个IDS基因（MsFPPS、MsGPPS和MsGGPPS）的功能。
研究策略
通过基于同源序列的PCR方法从苜蓿中克隆三个IDS基因，利用RACE获得全长cDNA；在大肠杆菌中异源表达并纯化重组蛋白，测定酶活性；用实时荧光定量PCR分析基因在不同组织及茉莉酸甲酯处理下的表达模式；在烟草中过表达三个基因，分析其对角鲨烯含量及植株表型的影响。
核心内容
本研究从苜蓿中克隆并功能鉴定了三个异戊烯基二磷酸合酶基因MsFPPS、MsGPPS和MsGGPPS。通过同源序列PCR结合RACE技术获得全长cDNA，三者开放阅读框分别编码342、301和370个氨基酸。在大肠杆菌中异源表达并纯化重组蛋白后，酶活性测定显示MsFPPS和MsGGPPS具有较高的催化活性，分别为111.65±1.85和129.52±2.15 nmol IPP/(min·mg)，而MsGPPS活性较低，仅略高于空载体对照。实时荧光定量PCR分析表明，茉莉酸甲酯处理5小时后MsFPPS和MsGPPS转录水平显著上调并达到峰值，而MsGGPPS则下降。在烟草中过表达MsFPPS使T0代转基因株系叶片角鲨烯含量约为对照的2倍，并诱导衰老样表型，而过表达MsGPPS和MsGGPPS的株系无显著变化。上述结果揭示MsFPPS不仅参与苜蓿三萜皂苷和植物甾醇前体合成，还可能在防御响应及植物生长调控中发挥双重作用，为后续利用该基因开展萜类代谢工程改造提供了依据。
创新点
首次从苜蓿中克隆并功能鉴定了三个编码异戊烯基二磷酸合酶的基因；发现过表达MsFPPS可使烟草叶片角鲨烯含量增加约2倍，并诱导衰老样反应，提示MsFPPS在萜类合成和植物生长调控中具有双重功能。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli (BL21 DE3) | 萜类生物合成途径（MVA/MEP途径下游） | MsFPPS | 法尼基二磷酸合酶（FPP synthase） | 催化 | 催化IPP与DMAPP缩合生成法尼基二磷酸（FPP），活性为111.65 nmol IPP/(min·mg) |
| Escherichia coli (BL21 DE3) | 萜类生物合成途径（MVA/MEP途径下游） | MsGPPS | 牻牛儿基二磷酸合酶小亚基（GPPS small subunit） | 催化 | 可能作为GPPS异源四聚体的小亚基，活性较低，为8.23 nmol IPP/(min·mg) |
| Escherichia coli (BL21 DE3) | 萜类生物合成途径（MVA/MEP途径下游） | MsGGPPS | 牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶（GGPP synthase） | 催化 | 催化IPP与DMAPP缩合生成牻牛儿基牻牛儿基二磷酸（GGPP），活性为129.52 nmol IPP/(min·mg) |
| Nicotiana tabacum (NC89) | 萜类生物合成途径（三萜/甾醇合成前体角鲨烯） | MsFPPS | 法尼基二磷酸合酶（FPP synthase） | 催化 | 组成型35S启动子驱动过表达，T0转基因株系角鲨烯含量约为对照的2倍，并出现叶片衰老样表型 |
关键发现
- 克隆得到MsFPPS cDNA全长1368 bp（ORF 1029 bp，编码342个氨基酸，预测蛋白分子量38.98 kDa，pI
- 94），MsGPPS cDNA全长1293 bp（ORF 906 bp，编码301个氨基酸，32.84 kDa，pI
- 63），MsGGPPS cDNA全长1623 bp（ORF 1113 bp，编码370个氨基酸，40.02 kDa，pI
- 33）。酶活性测定显示，重组MsFPPS活性为111.65±1.85 nmol IPP/(min·mg)，MsGGPPS为129.52±2.15，MsGPPS为8.23±0.21，空载体对照为5.86±0.11。过表达MsFPPS的T0转基因烟草角鲨烯含量约为对照的2倍，而MsGPPS和MsGGPPS过表达株系无明显变化。茉莉酸甲酯处理5小时后，MsFPPS和MsGPPS转录水平显著升高并达到峰值，而MsGGPPS转录水平下降。
研究结论
MsFPPS、MsGPPS和MsGGPPS编码功能性异戊烯基二磷酸合酶，其中MsFPPS可能参与苜蓿三萜皂苷和植物甾醇的生物合成，并在防御反应和植物生长调控中发挥作用。