A R2R3-MYB Transcription Factor from Epimedium sagittatum Regulates the Flavonoid Biosynthetic Pathway
- 作者
- Wenjun Huang, Wei Sun, Haiyan Lv, Ming Luo, Shaohua Zeng, Sitakanta Pattanaik, Ling Yuan, Ying Wang
- 单位
- Key Laboratory of Plant Germplasm Enhancement and Specialty Agriculture, Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, Hubei, China; Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Sustainable Utilization, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, Guangdong, China; Department of Plant and Soil Sciences, University of Kentucky, Lexington, Kentucky, United States of America
- 杂志
- PLoS ONE（2013）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0070778
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
淫羊藿属植物中参与黄酮类生物合成途径调控的R2R3-MYB转录因子尚不明确，导致对该药用植物中活性成分及花色形成的分子调控机制认识不足。
研究策略
从箭叶淫羊藿中分离候选R2R3-MYB转录因子基因EsMYBA1，通过序列分析、系统发育、表达模式、酵母双杂交、双分子荧光互补、双荧光素酶报告系统，以及在烟草和拟南芥中异源过表达和淫羊藿叶瞬时表达，全面鉴定其功能。
核心内容
该研究从箭叶淫羊藿中分离并功能鉴定了首个R2R3-MYB转录因子EsMYBA1。序列分析显示其开放阅读框长714 bp，编码237个氨基酸，R2R3保守域与拟南芥PAP1一致性达74%。通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验，证实EsMYBA1可与来自玉米、金鱼草、紫苏、拟南芥和烟草的多种bHLH蛋白互作。双荧光素酶报告实验表明，EsMYBA1与bHLH因子共表达可使拟南芥、烟草和淫羊藿来源的DFR启动子及淫羊藿ANS启动子活性额外提高2至4倍。在转基因拟南芥中，AtDFR和AtLDOX表达量分别上调超过900倍和150倍，烟草中多个类黄酮结构基因也显著上调。在淫羊藿叶片中瞬时表达EsMYBA1可诱导伤口处花青素积累。研究还发现该基因通过内含子保留产生三个可变剪接转录本。这些结果确立了EsMYBA1通过激活DFR和ANS等结构基因正向调控类黄酮生物合成的功能，为理解和工程化淫羊藿中药用黄酮类化合物的积累提供了分子基础。
创新点
首次在淫羊藿属中功能鉴定R2R3-MYB转录因子；发现EsMYBA1通过内含子保留产生三个可变剪接转录本；证明EsMYBA1可与多种bHLH转录因子互作并激活DFR和ANS启动子；异源过表达显著诱导花青素积累并影响整个类黄酮途径。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Epimedium sagittatum (箭叶淫羊藿) | 类黄酮/花青素生物合成 | EsMYBA1 | EsMYBA1 | 调控 | R2R3-MYB转录因子，可变剪接产生三个转录本，定位于细胞核。 |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 类黄酮/花青素生物合成 | NtPAL, NtCHI, NtF3H, NtDFR, NtANS | 苯丙氨酸解氨酶、查尔酮异构酶、黄烷酮3-羟化酶、二氢黄酮醇4-还原酶、花青素合酶 | 催化 | 在EsMYBA1过表达烟草中多数结构基因上调，尤其NtDFR和NtANS上调幅度较大。 |
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) | 花青素生物合成 | AtDFR, AtLDOX | 二氢黄酮醇4-还原酶、无色花青素双加氧酶 | 催化 | 过表达EsMYBA1后分别上调超过900倍和150倍。 |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 类黄酮调控网络 | NtAN1a, NtAN1b | NtAN1a, NtAN1b (bHLH转录因子) | 调控 | 与EsMYBA1互作，且在转基因烟草中被EsMYBA1上调表达。 |
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) | 类黄酮调控网络 | AtTT8 | AtTT8 (bHLH转录因子) | 调控 | 酵母双杂交和双荧光素酶实验证明与EsMYBA1互作并协同激活DFR启动子。 |
| Epimedium sagittatum (箭叶淫羊藿) | 类黄酮/花青素生物合成 | EsDFR, EsANS | 二氢黄酮醇4-还原酶、花青素合酶 | 催化 | 启动子被EsMYBA1及其与bHLH的组合激活。 |
| 酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 蛋白互作验证 | EsMYBA1, ZmLc, AmDelila, Perilla Myc-Rp, AtGL3, AtTT8, NtAN1a, NtAN1b | EsMYBA1及多种bHLH蛋白 | 调控 | 酵母双杂交证明EsMYBA1与7种bHLH存在物理互作。 |
关键发现
- EsMYBA1的ORF长714 bp，编码237个氨基酸
- 其R2R3保守域与山竹MYB10一致性79%，与拟南芥PAP1一致性74%，与柑橘Ruby一致性50%，与杨梅MYB1一致性48%。酵母双杂交实验表明EsMYBA1可与来自玉米Lc、金鱼草Delila、紫苏Myc-Rp、拟南芥GL3和TT8、烟草AN1a和AN1b等7种bHLH蛋白互作。双荧光素酶实验中，EsMYBA1与AtTT8或EsTT8共表达使DFR（来自拟南芥、烟草、淫羊藿）和ANS（来自淫羊藿）启动子活性比单独表达效应因子时额外提高2-4倍。转基因拟南芥中，AtDFR和AtLDOX表达量分别上调超过900倍和150倍。转基因烟草中多个结构基因（NtPAL、NtCHI、NtF3H、NtDFR、NtANS）及调控基因（NtAN1a、NtAN1b）表达上调，而Nt4CL和NtFLS下调。瞬时表达EsMYBA1可在淫羊藿叶片伤口处诱导花青素积累。
研究结论
EsMYBA1是淫羊藿中首个被功能鉴定的R2R3-MYB转录因子，通过激活DFR和ANS等结构基因并依赖与bHLH因子的互作来正向调控黄酮/花青素生物合成。该研究为理解和工程化淫羊藿中花青素及药用黄酮类化合物的积累模式奠定了基础。