Enhanced flux through the methylethritol 4-phosphate pathway in Arabidopsis plants overexpressing deoxyxylulose 5-phosphate reductoisomerase
- 作者
- Lorenzo Carretero-Paulet, Albert Cairo, Patricia Botella-Pavia, Oscar Besumbes, Narciso Campos, Albert Boronat, Manuel Rodriguez-Concepcion
- 杂志
- Plant Molecular Biology（2006）
- DOI
- 10.1007/s11103-006-9051-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
明确 MEP 途径中第二步酶 DXR 是否控制质体异戊二烯前体（IPP/DMAPP）的通量，以及其相对 DXS 的调控贡献。
研究策略
利用 35S 启动子构建 DXR 过表达（R 系）和 DXS 过表达（S 系）转基因拟南芥，通过福司米霉素（FSM）和氯马唑酮（CLM）抗性评估体内酶活性变化；结合 HPLC 和 GC-MS 测定叶绿素、类胡萝卜素及紫杉二烯含量，并通过杂交引入外源 TXS 报告系统量化 MEP 通量。
核心内容
该研究通过构建过表达DXR和DXS的转基因拟南芥，系统评估了MEP途径中这两个关键酶对质体异戊二烯前体通量的控制作用。利用35S启动子驱动目标基因表达，并结合福司米霉素和氯马唑酮抗性分析体内酶活性变化，同时通过HPLC和GC-MS测定叶绿素、类胡萝卜素含量，并引入来自红豆杉的紫杉二烯合成酶作为报告系统量化MEP通量。结果显示，DXR过表达株系叶绿素和类胡萝卜素含量较野生型提高约25%，而DXR沉默株系降低约20%并出现叶片花斑、叶绿体发育缺陷；在TXS背景下，过表达DXS使紫杉二烯积累提高6.5倍，过表达DXR提高3.5倍。DXR水平改变不影响DXS转录和蛋白积累，表明表型由DXR特异引起。研究首次在模式植物中证明DXR过表达可提升质体异戊二烯积累，且DXS和DXR协同控制MEP途径通量，但DXR过表达的增产幅度低于DXS，提示DXP供应可能成为进一步限速因素，为异戊二烯类化合物的代谢工程改造提供了重要靶点参考。
创新点
首次在模式植物拟南芥中证明 DXR 过表达可提高质体异戊二烯积累而不影响 DXS 表达；利用非天然产物紫杉二烯作为通量报告分子，证实 DXR 和 DXS 协同控制 MEP 途径通量；通过抑制剂抗性间接估算体内酶活性。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Arabidopsis thaliana | MEP 途径 | DXR | 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase | 催化 | 催化 DXP 转化为 MEP，第一个专一中间产物；过表达使叶绿素/类胡萝卜素提高约 25%，紫杉二烯提高 3.5 倍 |
| Arabidopsis thaliana | MEP 途径 | DXS | 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase | 催化 | 催化丙酮酸与甘油醛-3-磷酸缩合生成 DXP；过表达使紫杉二烯提高 6.5 倍，且对 CLM 抗性增强 |
| Arabidopsis thaliana (35S:TXS 转基因系) | MEP 途径 → GGPP | TXS | 紫杉二烯合成酶 (taxadiene synthase, 来自 Taxus baccata) | 催化 | 催化 GGPP 生成非天然产物紫杉二烯，作为 MEP 途径通量的报告分子 |
关键发现
- DXR 过表达株系（R-2 等）叶绿素和类胡萝卜素含量比野生型提高约 25%，而 DXR 沉默株系 R-3 降低约 20%；在 35S:TXS 背景下，过表达 DXS 使紫杉二烯积累提高
- 5 倍，过表达 DXR 提高
- 5 倍；DXR 沉默导致叶片花斑、叶绿体发育缺陷（类囊体膜减少、缺乏基粒）；DXR 水平的改变不影响 DXS 转录和蛋白积累，证明表型由 DXR 特异引起。
研究结论
DXR 催化的 MEP（途径第一个专一中间产物）合成步骤在拟南芥叶绿体中发挥通量控制作用，DXS 和 DXR 共同调控质体异戊二烯的供给；过表达 DXR 可增加异戊二烯产量，但幅度低于 DXS 过表达，提示 DXP 供应可能成为进一步限速因素。