Ectopic expression of a conifer Abscisic Acid Insensitive3 transcription factor induces high-level synthesis of recombinant human α-L-iduronidase in transgenic tobacco leaves
- 作者
- Allison R. Kermode, Ying Zeng, Xiaoke Hu, Samantha Lauson, Suzanne R. Abrams, Xu He
- 杂志
- Plant Molecular Biology（2007）
- DOI
- 10.1007/s11103-006-9122-y
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在转基因烟草叶片中组成型表达人α-L-艾杜糖苷酶（IDUA）时酶活性极低（0.04-0.34 pmol/min/mg TSP），且蛋白易降解；需要一种能在植物营养组织中高效、稳定生产该重组酶的策略。
研究策略
将来自太平洋香柏（Chamaecyparis nootkatensis）的B3结构域转录因子CnABI3在烟草中异位表达，通过反式激活种子特异性arc5-I启动子驱动的人IDUA基因表达，并联合外源ABA、代谢稳定ABA类似物或NaCl等胁迫处理进一步提高产物积累。
核心内容
针对转基因烟草叶片中组成型表达人α-L-艾杜糖苷酶活性极低且蛋白易降解的问题，研究人员将来自太平洋香柏的B3结构域转录因子CnABI3在烟草中异位表达，反式激活种子特异性arc5-I启动子驱动的人IDUA基因，并尝试外源ABA及其代谢稳定类似物或NaCl胁迫处理进一步增强产物积累。结果显示，仅组成型表达35S-hIDUA的叶片酶活性仅为0.04–0.34 pmol/min/mg TSP，而共表达CnABI3与Arc-hIDUA的最高株系活性升至1,180 pmol/min/mg TSP；在150–200 μM S(+)-ABA处理下活性最高可达25,000 pmol/min/mg TSP，NaCl处理效果优于ABA。此外，C端融合SEKDEL内质网滞留信号可增强蛋白积累且不改变mRNA水平。该策略首次在营养组织中利用松柏类转录因子高效反式激活种子特异性启动子，为利用植物细胞培养生产重组人治疗酶提供了可行途径。
创新点
首次在营养组织中利用松柏类CnABI3转录因子反式激活种子特异性启动子实现重组人IDUA的高水平诱导合成；证实ABA类似物和NaCl可替代天然ABA有效诱导表达；证明在IDUA C端融合SEKDEL内质网滞留信号增强蛋白积累。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 转基因烟草（Nicotiana tabacum） | ABA信号通路 | CnABI3 | CnABI3转录因子 | 调控 | 来自太平洋香柏（Chamaecyparis nootkatensis）的ABI3同源基因，异位表达后反式激活种子特异性启动子。 |
| 转基因烟草（Nicotiana tabacum） | 糖胺聚糖降解 | IDUA | 人α-L-艾杜糖苷酶 | 催化 | 重组人溶酶体酶，用于治疗粘多糖贮积症I型（MPS I）。 |
| 转基因烟草（Nicotiana tabacum） | 报告基因检测 | GUS | β-葡萄糖醛酸酶 | 催化 | 用于分析启动子调控活性的报告酶。 |
| 转基因烟草（Nicotiana tabacum） | 种子特异性基因表达 | arc5-I启动子 | — | 调控 | 来自菜豆（Phaseolus vulgaris）arc5-I基因的5'调控区，受CnABI3和ABA诱导。 |
| 转基因烟草（Nicotiana tabacum） | 种子特异性基因表达 | vicilin启动子 | — | 调控 | 来自豌豆的种子贮藏蛋白基因启动子，可被CnABI3激活。 |
| 转基因烟草（Nicotiana tabacum） | 蛋白分泌途径 | SEKDEL | 内质网滞留信号（SEKDEL） | 区室化 | 与IDUA蛋白C端融合后使其滞留于内质网腔，提高重组蛋白稳定性。 |
关键发现
- 组成型表达35S-hIDUA的5个转基因株系叶片中IDUA活性仅为0.04–0.34 pmol/min/mg TSP，并出现蛋白降解片段
- 共表达CnABI3与Arc-hIDUA的最高株系叶片IDUA活性达1,180 pmol/min/mg TSP，与Arc-hIDUA-KDEL共表达的最高达360 pmol/min/mg TSP（无外源ABA）
- 在150–200 μM S(+)-ABA处理下，共表达叶片IDUA活性最高可达25,000 pmol/min/mg TSP
- 150 μM S(+)-ABA使Arc-hIDUA-KDEL共表达叶片IDUA活性较未处理对照提高约40倍，其他株系最高达50倍
- 10 μM (+)-8'-acetylene ABA对Vic-GUS的诱导活性比天然S(+)-ABA高16倍
- 300 mM NaCl处理对IDUA活性的促进作用优于150 μM S(+)-ABA
- C端添加SEKDEL序列后在ABA存在时IDUA蛋白和活性积累更高，但mRNA稳态水平无显著差异。
研究结论
异位表达CnABI3能高效反式激活种子特异性启动子驱动的外源基因，在烟草叶片中诱导高水平重组人IDUA的合成；外源ABA及其代谢稳定类似物或NaCl等胁迫处理均可进一步增强诱导效果，该系统可望用于植物细胞培养生产重组人类治疗酶。