Trichome-specific expression of the amorpha-4,11-diene 12-hydroxylase (cyp71av1) gene, encoding a key enzyme of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua, as reported by a promoter-GUS fusion
- 作者
- Hongzhen Wang, Junli Han, Selvaraju Kanagarajan, Anneli Lundgren, Peter E. Brodelius
- 杂志
- Plant Molecular Biology（2012）
- DOI
- 10.1007/s11103-012-9986-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析青蒿素生物合成关键酶CYP71AV1基因启动子的组织特异性表达模式，为通过代谢工程提高青蒿素产量提供分子工具和理论依据。
研究策略
克隆cyp71av1基因启动子并构建启动子-GUS融合载体，通过农杆菌介导稳定转化两种青蒿品种（Chongqing和Anamed）及烟草，利用组织化学染色、qPCR、Southern blot等方法分析启动子的时空表达特性、激素响应及转基因拷贝数，并比较ads与cyp71av1启动子的顺式元件。
核心内容
该研究克隆了青蒿中青蒿素生物合成关键酶CYP71AV1的1,148 bp启动子（GenBank FJ870128），构建启动子-GUS融合载体并通过农杆菌转化青蒿两个品种及烟草，以解析其组织特异性表达模式。组织化学染色显示，GUS在叶原基和上部叶片的腺毛中特异表达，老叶中信号转向T型毛，极老叶中消失。值得注意的是，重组启动子的活性比野生型高约200倍，在花蕾中高250至500倍，推测克隆过程中丢失了沉默性顺式元件，使其具有去调控特性。在MeJA处理下，Chongqing品种24 h时CYP71AV1和GUS转录分别被诱导23倍和75倍，Anamed品种48 h时分别诱导51倍和8倍。启动子与ads启动子共享ABRE、Box-W1、G-box等顺式元件，提示协同调控。该启动子携带腺毛特异表达所需的主要顺式元件，且因缺失沉默元件而活性增强，可直接用于青蒿素途径的代谢工程改造。
创新点
首次报道cyp71av1启动子在叶原基和上部叶片的腺毛中特异表达，发现重组启动子比野生型启动子活性高约200倍（花蕾中高250-500倍），推测克隆过程丢失了沉默性顺式作用元件，使启动子具有去调控特性，可直接用于青蒿素代谢工程。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua (Chongqing和Anamed品种) | 青蒿素生物合成 | cyp71av1 | CYP71AV1 (amorpha-4,11-diene 12-hydroxylase) | 催化 | 核心研究对象，克隆其启动子并分析启动子-GUS融合表达模式 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | ads | ADS (amorpha-4,11-diene synthase) | 催化 | 与cyp71av1启动子比较，二者共享多个顺式调控元件，提示协同调控 |
| Nicotiana tabacum | 青蒿素生物合成（异源表达） | cyp71av1启动子 | — | 调控 | 启动子驱动GUS在烟草腺毛头部特异表达，证明可跨物种应用 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | AaERF1/AaERF2 | AaERF1/AaERF2 | 调控 | JA响应AP2/ERF转录因子，可增强cyp71av1启动子活性（六倍诱导） |
关键发现
- 克隆到1,148 bp的cyp71av1启动子（GenBank FJ870128）
- GUS表达在叶原基和上部叶片的腺毛中特异性定位，老叶中转向T型毛，下部叶片仅T型毛表达，极老叶无表达
- 重组启动子比野生型启动子活性高约200倍，在花蕾中高250-500倍
- MeJA处理Chongqing品种24 h时CYP71AV1和GUS转录分别诱导23倍和75倍，Anamed品种48 h时分别诱导51倍和8倍
- cyp71av1启动子与ads启动子共有多个顺式调控元件（ABRE、Box-W1、E-box、G-box、MBS、RAA-motif等），提示协同调控
- 在烟草中驱动GUS在腺毛头部特异表达
- Southern blot显示转基因拷贝数为1-3个不等。
研究结论
克隆的cyp71av1启动子携带GST特异性表达所需的主要顺式元件，因缺失某些沉默元件而活性增强，可作为优良的启动子用于青蒿素生物合成途径的代谢工程改造。