Combinatorial Engineering of 1-Deoxy-D-Xylulose 5-Phosphate Pathway Using Cross-Lapping In Vitro Assembly (CLIVA) Method
- 作者
- Ruiyang Zou, Kang Zhou, Gregory Stephanopoulos, Heng Phon Too
- 单位
- Chemical and Pharmaceutical Engineering, Singapore-MIT Alliance, Singapore, Singapore; Department of Biochemistry, National University of Singapore, Singapore, Singapore; Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, United States of America
- 杂志
- PLoS ONE（2013）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0079557
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏快速、低成本、可一步组装多个大型DNA片段到质粒的方法，且难以系统探索代谢途径中多基因组合对目标产物产量的影响。
研究策略
开发基于硫代磷酸酯化学的酶不依赖体外组装方法（CLIVA），通过新型交叉搭接（cross-lapping）引物设计、优化阳离子浓度、重叠长度及硫代磷酸酯修饰频率，高效组装多模块质粒；并利用该方法构建DXP途径系列组合质粒，结合代谢物谱分析评估基因过表达对amorphadiene生产的影响。
核心内容
该研究开发了一种基于硫代磷酸酯化学的酶不依赖体外组装方法（CLIVA），用于快速、低成本地一步组装多个大型DNA片段。通过设计交叉搭接引物延长同源臂，并在每隔4至5个碱基的位置引入硫代磷酸酯修饰，结合2.5 mM MgCl2的优化条件，实现了从7个模块一步组装21.6 kb的大质粒，包含16个DXP途径基因，效率达2.0×10^3 cfu/μg DNA，全程仅需1至2天。利用该方法构建了16个DXP途径基因组合质粒并转入大肠杆菌，系统评估各基因过表达对amorphadiene产量的影响。结果表明，过表达ispG/ispH或dxr/ispD/ispE/ispF模块会显著抑制产量，且胞内MEC积累与产量呈负相关；而过表达铁硫簇Isc操纵子可适度提升产量，但总体仍低于仅过表达dxs的菌株。这些发现提示DXP途径中多基因过表达可能因中间代谢物积累引发反馈抑制，而补充铁硫簇可部分缓解限速步骤。该工作为代谢途径的多基因组合优化提供了高效工具，也揭示了异戊二烯合成途径中复杂的调控机制。
创新点
['提出cross-lapping引物设计，使重叠序列与基因特异序列互补，在不增加引物成本的前提下延伸同源臂长度', '发现仅在部分碱基位点引入硫代磷酸酯修饰（每隔4-5个碱基）即可高效切割组装，显著降低成本', '发现MgCl2等阳离子能大幅提升组装效率，并确定最优浓度2.5 mM', '实现从7个模块一步组装21.6 kb大质粒（含16个途径基因），效率达2.0×10^3 cfu/μg DNA', '首次系统评估DXP途径基因组合对amorphadiene产量的影响，发现某些基因过表达反而抑制产量']
研究对象（22）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | DXP途径（非甲羟戊酸途径） | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶 | 催化 | 催化DXP途径第一步缩合反应，过表达可提高amorphadiene产量 |
| Escherichia coli | DXP途径（非甲羟戊酸途径） | dxr | DXP还原异构酶 | 催化 | 催化DXP生成MEP，过表达与dxs组合导致MEP积累 |
| Escherichia coli | DXP途径（非甲羟戊酸途径） | ispD | 2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶 | 催化 | 催化MEP生成CDP-ME |
| Escherichia coli | DXP途径（非甲羟戊酸途径） | ispE | 4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶 | 催化 | 催化CDP-ME磷酸化生成CDP-MEP |
| Escherichia coli | DXP途径（非甲羟戊酸途径） | ispF | 2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶 | 催化 | 催化CDP-MEP生成MEC，过表达导致MEC积累 |
| Escherichia coli | DXP途径（非甲羟戊酸途径） | ispG | 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶 | 催化 | 催化MEC生成HMBPP，需铁硫簇辅因子；过表达导致HMBPP积累 |
| Escherichia coli | DXP途径（非甲羟戊酸途径） | ispH | HMBPP还原酶 | 催化 | 催化HMBPP生成IPP和DMAPP，需铁硫簇辅因子 |
| Escherichia coli | DXP途径（非甲羟戊酸途径） | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 催化IPP与DMAPP互变 |
| Escherichia coli | DXP途径（非甲羟戊酸途径） | ispA | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP/DMAPP缩合生成GPP和FPP |
| Escherichia coli | amorphadiene合成 | ADS | amorphadiene合酶（青蒿来源，密码子优化） | 催化 | 催化FPP环化生成amorphadiene，抗疟药物青蒿素前体 |
| Escherichia coli | 铁硫簇组装（Isc操纵子） | iscS | 半胱氨酸脱硫酶 | 催化 | 提供硫元素用于铁硫簇合成 |
| Escherichia coli | 铁硫簇组装（Isc操纵子） | iscU | 铁硫簇支架蛋白 | 催化 | 作为铁硫簇组装的支架 |
| Escherichia coli | 铁硫簇组装（Isc操纵子） | iscA | 铁硫簇组装蛋白A | 催化 | 参与铁硫簇组装 |
| Escherichia coli | 铁硫簇组装（Isc操纵子） | hscB | 共伴侣蛋白HscB | 催化 | 辅助HscA参与铁硫簇组装 |
| Escherichia coli | 铁硫簇组装（Isc操纵子） | hscA | 分子伴侣HscA | 催化 | 依赖ATP的分子伴侣，协助铁硫簇转移 |
| Escherichia coli | 铁硫簇组装（Isc操纵子） | fdx | 铁氧还蛋白 | 催化 | 提供电子参与铁硫簇合成 |
| Escherichia coli | 铁硫簇组装（Suf操纵子） | sufA | 铁硫簇组装蛋白SufA | 催化 | Suf途径中支架蛋白 |
| Escherichia coli | 铁硫簇组装（Suf操纵子） | sufB | 铁硫簇组装蛋白SufB | 催化 | Suf途径核心支架蛋白 |
| Escherichia coli | 铁硫簇组装（Suf操纵子） | sufC | ATP酶SufC | 能量供给 | 通过水解ATP驱动铁硫簇组装 |
| Escherichia coli | 铁硫簇组装（Suf操纵子） | sufD | 铁硫簇组装蛋白SufD | 催化 | 参与铁硫簇组装复合物 |
| Escherichia coli | 铁硫簇组装（Suf操纵子） | sufS | 半胱氨酸脱硫酶SufS | 催化 | 提供硫元素 |
| Escherichia coli | 铁硫簇组装（Suf操纵子） | sufE | 硫转移酶SufE | 催化 | 增强SufS活性，传递硫 |
关键发现
- CLIVA方法可在1-2天内完成大质粒组装，从7个模块成功组装21.6 kb质粒（含16个DXP途径基因），效率为2.0×10^3 cfu/μg input DNA。优化结果显示，MgCl2最佳浓度为2.5 mM
- 长重叠序列（36-38 bp）比短重叠（12-13 bp）组装效率提高约3倍
- 仅单个硫代磷酸酯修饰即可实现两个片段（约3-4 kb）的高效组装（约2.0×10^6 cfu/μg input DNA）。通过16个质粒的组合筛选，发现过表达GH模块（ispG、ispH）或R-DEF模块（dxr、ispD、ispE、ispF）会显著抑制amorphadiene产量，且胞内MEC（甲基赤藓醇环二磷酸）积累浓度与产量呈负相关。过表达铁硫簇Isc操纵子（iscS、iscU、iscA、hscB、hscA、fdx）可适度提高amorphadiene产量，但总体低于仅过表达dxs（S模块）的菌株。
研究结论
CLIVA是一种高效、低成本、无需连接酶的DNA多片段一步组装方法，可快速构建大型质粒，适用于代谢通路组合优化。本研究发现DXP途径中多个基因的过表达并不总能提高异戊二烯产量，反而可能因MEC积累造成反馈抑制或应激；补充铁硫簇可部分缓解ispG/ispH的限速。该方法为系统解析多基因互作及优化微生物细胞工厂提供了有力工具。