An improved chemically inducible gene switch that functions in the monocotyledonous plant sugar cane
- 作者
- Mark Kinkema, R. Jason Geijskes, Kylie Shand, Heather D. Coleman, Paulo C. De Lucca, Anthony Palupe, Mark D. Harrison, Ian Jepson, James L. Dale, Manuel B. Sainz
- 单位
- Syngenta Centre for Sugar Cane Biofuels Development, Centre for Tropical Crops and Biocommodities, Queensland University of Technology, Brisbane, QLD 4001, Australia
- 杂志
- Plant Molecular Biology（2013）
- DOI
- 10.1007/s11103-013-0140-2
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
原始的alc乙醇诱导基因开关在单子叶植物甘蔗中功能无效，需要改进使其能在这一重要作物中有效工作，以支持基础研究和作物生物技术应用。
研究策略
对alcR和GUS编码序列进行甘蔗密码子优化，设计九种alcA启动子变体，包括串联重复AlcR反向重复结合位点、延长CaMV 35S最小启动子、加入玉米Adh1内含子等，通过农杆菌介导转化甘蔗，用乙醇处理评估诱导表达效率。
核心内容
该研究针对源自构巢曲霉的乙醇诱导alc基因开关在单子叶植物甘蔗中功能失效的问题，对alcR转录因子和GUS报告基因进行甘蔗密码子优化，并构建了九种alcA启动子变体，通过农杆菌介导转化甘蔗评估乙醇诱导效率。结果显示，原始alc开关在21个转基因系中经2%或10%乙醇处理均无GUS活性，而优化后的var4在2%乙醇下80%植物（8/10）显示GUS染色，var5和var9在1%乙醇下分别有63%和41%植物被诱导，三者均含五个串联AlcR反向重复结合位点，说明该结构是提升乙醇敏感性的关键。单拷贝转基因系中var5最大GUS积累量为53-193 ng/mg蛋白，与玉米Ubiquitin1组成型启动子相当；27个含优化开关的植物中24个未诱导时GUS低于检测限，3个泄漏表达仅约1.1 ng/mL，一个诱导系GUS增加约100倍。诱导方式上，根施5%乙醇可有效驱动叶片和茎部表达，优于叶面喷施；5%乙醇对甘蔗无毒，10%则严重伤害老叶。该改进使alc开关首次在甘蔗中实现高效可控表达，有望推广至其他单子叶作物。
创新点
首次在甘蔗中实现功能性alc基因开关；发现五个串联的AlcR反向重复结合位点单独即可显著提高乙醇敏感性和诱导表达；证明根施乙醇比叶面喷施更有效；优化后最大GUS积累量与组成型启动子相当。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 甘蔗（Saccharum officinarum，品种Q117和KQ228） | 乙醇诱导基因表达系统（alc系统，源自构巢曲霉） | alcR | AlcR | 调控 | 转录因子，乙醇存在时激活alcA启动子 |
| 甘蔗（Saccharum officinarum） | 乙醇诱导基因表达系统（alc系统） | scoalcR | AlcR（密码子优化） | 调控 | 甘蔗优化密码子的alcR编码序列，提高在甘蔗中的表达 |
| 甘蔗（Saccharum officinarum） | 乙醇诱导基因表达系统（alc系统） | GUS/uidA | GUS（β-葡萄糖醛酸酶） | 催化 | 报告基因，用于检测启动子活性 |
| 甘蔗（Saccharum officinarum） | 乙醇诱导基因表达系统（alc系统） | scoGUS | GUS（密码子优化） | 催化 | 甘蔗优化密码子的GUS编码序列 |
| 甘蔗（Saccharum officinarum） | 乙醇诱导基因表达系统（alc系统） | alcA（启动子） | — | 调控 | 原生alcA启动子及其变体，包含AlcR结合位点，驱动下游基因表达 |
关键发现
原始alc开关在21个转基因甘蔗中经2%或10%乙醇诱导均未检测到GUS。优化后的var4在2%乙醇处理下80%植物（8/10）显示GUS染色，var5和var9在1%乙醇下分别有63%和41%植物诱导。var4、var5和var9均含五个串联AlcR反向重复结合位点。单拷贝转基因甘蔗中，var5最大GUS积累量为53-193 ng/mg蛋白，与ZmUbi1组成型启动子相当。根施5%乙醇可有效诱导叶片和茎部表达，而叶面喷施效果弱或无。在27个含var4/var5/var9的植物中，24个未诱导时GUS蛋白低于检测限（约1.8 ng/mL），3个有低水平泄漏表达（1.1±0.63 ng/mL）。一个转基因系诱导后GUS蛋白增加约100倍。乙醇毒性实验显示5%乙醇对甘蔗无害，7.5%引起老叶衰老，10%对老植物严重毒性。
研究结论
开发了在甘蔗中功能改善的alc基因开关，五个串联AlcR反向重复结合位点是关键改进，根施乙醇可有效诱导表达，该开关有望推广至其他单子叶植物并改进双子叶植物中的使用。