高级醇 · 代谢工程文献库

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Investigating sesquiterpene biosynthesis in Ginkgo biloba: molecular cloning and functional characterization of (E,E)-farnesol and α-bisabolene synthases

作者
Iffat Parveen, Mei Wang, Jianping Zhao, Amar G. Chittibovina, Nurhayat Tabanca, Abbas Ali, Scott R. Baerson, Natascha Techen, Joe Chappell, Ikhlas A. Khan, Zhiqiang Pan
单位
National Center for Natural Products Research, Thad Cochran Research Center, School of Pharmacy, University of Mississippi, University, MS 38677, USA; United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Natural Products Utilization Research Unit (USDA-ARS-NPURU), P.O. Box 1848, University, MS 38677-1848, USA; Department of Pharmaceutical Sciences, University of Kentucky, Lexington, KY 405036, USA
杂志
Plant Molecular Biology（2015）
DOI
10.1007/s11103-015-0381-3
所属领域
代谢工程
关键词
Bisabolene synthaseFarnesol synthaseGinkgo bilobaSesquiterpene
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解决的核心问题

银杏中倍半萜生物合成酶缺乏鉴定，需要克隆并功能表征参与倍半萜合成的关键酶。

研究策略

利用公共RNA-seq数据挖掘候选萜类合酶基因，通过RACE克隆全长ORF，在大肠杆菌和酵母中异源表达，结合GC-MS和NMR鉴定产物，进行系统进化和组织表达分析。

研究路线图

100%
研究问题：银杏倍半萜生物合成关键酶缺乏鉴定
策略：RNA-seq挖掘候选基因，RACE克隆全长ORF
关键改造：大肠杆菌/酵母异源表达GbTPS1与GbTPS2
结果1：GbTPS1催化FPP生成(E,E)-法尼醇（Cm=142.9μM）
结果2：GbTPS2催化FPP生成α-红没药烯（Cm=77.42μM）
结果3：基因表达谱-种子vs茎、成熟叶vs未成熟叶差异显著
结论：首次鉴定银杏两个单产物倍半萜合酶，属于TPS-d亚家族
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核心内容

该研究通过挖掘公共RNA-seq数据并结合RACE技术，从银杏中克隆了两个倍半萜合酶基因GbTPS1和GbTPS2，并在大肠杆菌和酵母中异源表达，利用GC-MS和NMR鉴定其产物。结果显示GbTPS1以法尼基焦磷酸（FPP）为底物特异性生成(E,E)-法尼醇，其Km为142.9 μM，kcat为0.004 s⁻¹；GbTPS2则生成(-)-α-红没药烯，Km为77.42 μM，kcat为0.01 s⁻¹，且两者均不能利用牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP），表现出严格的底物特异性。从175 mg酵母提取物中纯化获得6.9 mg α-红没药烯，比旋光度为-92.6。组织表达分析表明，GbTPS1在种子中的转录水平比茎高约30倍，GbTPS2在成熟叶中的表达比未成熟叶高约80倍，提示其参与发育调控和化学防御。这是首次在裸子植物中报道法尼醇合酶，系统发育分析显示这两个酶属于古老的TPS-d亚家族，可能由祖先二萜合酶进化而来。该工作为理解原始裸子植物倍半萜生物合成的进化及代谢工程应用提供了基础。

创新点

首次从银杏中克隆并功能鉴定两个倍半萜合酶（(E,E)-法尼醇合酶GbTPS1和α-红没药烯合酶GbTPS2）；首次报道裸子植物的法尼醇合酶；两个酶均产生单一产物，区别于大多数多产物倍半萜合酶；系统发育表明其属于古老TPS-d亚家族，可能从祖先二萜合酶进化而来。

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli BL21(DE3) 倍半萜生物合成 GbTPS1 (E,E)-farnesol synthase 催化 重组表达用于酶活测定和GC-MS产物鉴定，催化FPP生成(E,E)-farnesol
Escherichia coli BL21(DE3) 倍半萜生物合成 GbTPS2 α-bisabolene synthase 催化 重组表达用于酶活测定和GC-MS产物鉴定，催化FPP生成α-bisabolene
Saccharomyces cerevisiae INVSc1 倍半萜生物合成 GbTPS2 α-bisabolene synthase 催化 在酵母中过表达用于大量制备产物，经NMR鉴定为(-)-α-bisabolene

关键发现

  1. GbTPS1以FPP为底物生成(E,E)-farnesol，Km=142.9 μM，kcat=0.004 s^-1
  2. GbTPS2以FPP为底物生成(-)-α-bisabolene，Km=77.42 μM，kcat=0.01 s^-1
  3. 从175 mg酵母提取物中纯化得到6.9 mg α-bisabolene，比旋光度[α]D^20=-92.6
  4. GbTPS1在种子中的转录水平比茎高约30倍
  5. GbTPS2在成熟叶中的转录水平比未成熟叶高约80倍
  6. 两种酶均不能利用GGPP，对FPP具有底物特异性。

研究结论

本研究成功克隆并功能表征了银杏中的两个倍半萜合酶基因GbTPS1和GbTPS2，它们分别催化FPP生成(E,E)-法尼醇和α-红没药烯，为单一产物特异性酶。组织表达分析表明它们可能参与银杏的发育调控和化学防御。该工作为理解原始裸子植物的倍半萜生物合成和进化提供了基础。