Elucidating the Pseudomonas aeruginosa Fatty Acid Degradation Pathway: Identification of Additional Fatty Acyl-CoA Synthetase Homologues
- 作者
- Jan Zarzycki-Siek, Michael H. Norris, Yun Kang, Zhenxin Sun, Andrew P. Bluhm, Ian A. McMillan, Tung T. Hoang
- 单位
- Department of Microbiology, University of Hawaii at Manoa; Department of Molecular Bioscience and Bioengineering, University of Hawaii at Manoa
- 杂志
- PLoS ONE（2013）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0064554
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明铜绿假单胞菌脂肪酸降解途径中的脂酰辅酶A合成酶（FadD）同源物，确定除已知fadD1/fadD2外参与脂肪酸活化的额外基因及其在感染中的功能。
研究策略
以大肠杆菌FadD序列为基础进行生物信息学筛选，通过功能互补实验验证候选基因；构建17种组合fadD基因敲除突变体，分析其在多种脂肪酸、磷脂酰胆碱及植物源萜烯上的生长表型；并通过小鼠肺部感染模型评估突变体的适应性。
核心内容
该研究以铜绿假单胞菌PAO1为对象，系统阐明了其脂肪酸降解途径中脂酰辅酶A合成酶（FadD）同源物的组成与功能。作者以大肠杆菌FadD序列进行生物信息学筛选，通过功能互补实验验证候选基因，并构建17种组合fadD基因敲除突变体分析其在不同脂肪酸和植物源萜烯上的生长表型，同时利用小鼠肺部感染模型评估突变体适应性。研究新鉴定并功能验证了4个fadD同源基因（fadD3/PA3860、fadD4/PA1617、fadD5/PA2893、fadD6/PA3924），从而确定该菌共有6个有氧脂酰辅酶A合成酶基因。结果表明，fadD4在脂肪酸和植物源无环萜烯降解中发挥双重主导作用，其突变株在香茅酸上生长OD仅为野生型的20%或更少；六重fadD突变体在C6:0至C18:1脂肪酸上完全不能生长，在体外竞争实验中于油酸和磷脂酰胆碱上的竞争指数分别约为0.15和0.3，在小鼠感染24小时时数量仅为补偿菌株的一半。这些发现证实脂肪酸作为营养物对感染早期复制有贡献，但后期存在替代营养途径，为理解致病菌营养适应机制提供了新认识。
创新点
新鉴定并功能验证了4个fadD同源基因（fadD3/PA3860、fadD4/PA1617、fadD5/PA2893、fadD6/PA3924），确定铜绿假单胞菌共有6个有氧脂酰辅酶A合成酶基因；揭示fadD4在脂肪酸和植物源无环萜烯降解中的双重主导作用；构建六重fadD突变体并证明其体内适应性下降。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 铜绿假单胞菌PAO1 | 脂肪酸β-氧化 | fadD1 (PA3299) | FadD1 | 催化 | 长链脂肪酸酰基辅酶A合成酶，主要参与LCFA降解 |
| 铜绿假单胞菌PAO1 | 脂肪酸β-氧化 | fadD2 (PA3300) | FadD2 | 催化 | 对短链脂肪酸活性较高，参与SCFA/MCFA降解 |
| 铜绿假单胞菌PAO1 | 脂肪酸β-氧化 | fadD3 (PA3860) | FadD3 | 催化 | 新鉴定同源物，主要降解C6:0-C12:0 |
| 铜绿假单胞菌PAO1 | 脂肪酸β-氧化/无环萜烯利用 | fadD4 (PA1617) | FadD4 | 催化 | 新鉴定同源物中对脂肪酸降解贡献最大，也负责香茅酸和牻牛儿酸的活化 |
| 铜绿假单胞菌PAO1 | 脂肪酸β-氧化/无环萜烯利用 | fadD5 (PA2893) | FadD5 | 催化 | 又称atuH，参与脂肪酸降解（C6:0-C14:0），对香茅酸/牻牛儿酸降解贡献小 |
| 铜绿假单胞菌PAO1 | 脂肪酸β-氧化 | fadD6 (PA3924) | FadD6 | 催化 | 新鉴定同源物，主要降解C6:0-C12:0 |
| 大肠杆菌K-12 | 脂肪酸β-氧化 | fadD | FadD | 催化 | 用于功能互补测试的参照基因，E. coli脂酰辅酶A合成酶 |
关键发现
- 从11个候选基因中鉴定出4个新的fadD同源基因（PA1617、PA2893、PA3860、PA3924）
- 单拷贝互补实验表明它们可将大肠杆菌fadD突变体在C14:0-C18:1上恢复至野生型水平，在C10:0上支持微弱生长
- 组合突变体生长表型显示fadD4贡献最大，fadD3/fadD5/fadD6也有不同程度参与，六重突变体在C6:0-C18:1上完全不能生长
- fadD4突变株在香茅酸和牻牛儿酸上生长OD仅为PAO1的20%或更少
- 体外竞争实验中六重突变体在油酸和磷脂酰胆碱上的竞争指数分别约为0.15和0.3
- 小鼠感染实验中六重突变体在24小时时的数量仅为补偿菌株的一半。
研究结论
铜绿假单胞菌的脂肪酸降解需要6个有氧脂酰辅酶A合成酶（FadD1-6），其中FadD4在脂肪酸及植物源无环萜烯降解中发挥关键作用；脂肪酸作为营养物对小鼠肺部感染早期复制有贡献，但感染后期存在替代营养途径。