The "putative" role of transcription factors from HWRKY family in the regulation of the final steps of prenylflavonid and bitter acids biosynthesis in hop (Humulus lupulus L.)
- 作者
- Jaroslav Matoušek, Tomáš Kocábek, Josef Patzak, Jindřich Bříza, Kristýna Siglová, Ajay Kumar Mishra, Ganesh Selvaraj Duraisamy, Anna Týcová, Eiichiro Ono, Karel Krofta
- 单位
- Biology Centre of the Czech Academy of Sciences v.v.i, Institute of Plant Molecular Biology, Branišovská 31, 370 05 České Budějovice, Czech Republic; Hop Research Institute, Co. Ltd., Kadaňská 2525, 438 46 Žatec, Czech Republic; Faculty of Science, University of South Bohemia in České Budějovice, Branišovská 1760, 370 05 České Budějovice, Czech Republic; Research Institute, Suntory Global Innovation Center (SIC) Ltd., 1-1-1 Wakayamadai, Shimamoto, Mishima, Osaka 618-8503, Japan
- 杂志
- Plant Molecular Biology（2017）
- DOI
- 10.1007/s11103-016-0510-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析啤酒花（Humulus lupulus）lupulin腺体中WRKY转录因子家族在黄腐酚（xanthohumol）和苦味酸（bitter acids）生物合成最后步骤中的调控作用。
研究策略
从啤酒花lupulin腺体cDNA文库中克隆WRKY转录因子，结合烟草（Nicotiana benthamiana）瞬时表达系统、EMSA、转基因啤酒花、5'降解组分析等方法，研究HlWRKY1对关键结构基因启动子的激活及其调控特征。
研究路线图
核心内容
本研究从啤酒花（Humulus lupulus）lupulin腺体cDNA文库中克隆了四个WRKY转录因子，并系统解析了其中HlWRKY1在黄腐酚和苦味酸生物合成最后步骤中的调控作用。表达分析显示，HlWRKY1在lupulin腺体中表达水平最高，根部仅为腺体水平的18%。通过烟草瞬时表达、EMSA和生物弹击等实验，发现HlWRKY1能够激活黄腐酚和苦味酸途径多个关键结构基因（如Omt1、Chs_H1、Vps、Prt1）的启动子，且与HlWDR1及病毒沉默抑制子p19或HC-Pro共表达时激活显著增强，其中p19和HC-Pro分别使激活提高约6倍和7倍。在转基因啤酒花中，HlWRKY1表达量达对照的4318%至25704%，并伴随Omt1、Chs_H1、Vps、Prt1L转录水平同步升高。研究还发现HlWRKY1受转录后基因沉默调控，鉴定到‘microwry’小RNA，并证明蛋白激酶HlCDKF1可激活HlWRKY1，共表达使GUS活性增加约44%。结果表明HlWRKY1是啤酒花lupulin生物合成调控网络的重要组分，为解析黄腐酚和苦味酸合成的转录调控机制及代谢工程改造提供了关键靶点。
创新点
首次克隆并鉴定四个啤酒花WRKY转录因子，发现lupulin腺体特异的HlWRKY1能激活黄腐酚和苦味酸生物合成途径多个关键酶基因启动子；发现HlWRKY1与HlWDR1协同增强启动子激活；揭示HlWRKY1受PTGS调控并鉴定到'microwry'小RNA；证明蛋白激酶HlCDKF1可激活HlWRKY1。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Humulus lupulus | prenylflavonoid/bitter acids biosynthesis | HlWRKY1 | HlWRKY1 | 调控 | lupulin腺体特异转录因子，与AtWRKY75同源，激活黄腐酚和苦味酸途径关键酶基因启动子 |
| Humulus lupulus | prenylflavonoid/bitter acids biosynthesis | HlWDR1 | HlWDR1 | 调控 | WD40重复蛋白，与HlWRKY1协同增强启动子激活 |
| Humulus lupulus | xanthohumol biosynthesis | HlOmt1 | OMT1 | 催化 | O-甲基转移酶1，催化黄腐酚生物合成最后甲基化步骤 |
| Humulus lupulus | prenylflavonoid/bitter acids biosynthesis | HlChs_H1 | CHS | 催化 | 查尔酮合酶，参与黄腐酚和苦味酸合成 |
| Humulus lupulus | bitter acids biosynthesis | HlVps | VPS | 催化 | 缬草苯酮合酶，苦味酸生物合成关键酶 |
| Humulus lupulus | prenylflavonoid/bitter acids biosynthesis | HlPrt1, HlPrt1L, HlPrt2 | PRT | 催化 | 异戊烯基转移酶，参与黄腐酚和苦味酸合成 |
| Humulus lupulus | regulatory network | HlMyb3 | HlMyb3 | 调控 | R2R3MYB转录因子，受HlWRKY1激活，参与chs_H1调控 |
| Humulus lupulus | regulatory network | HlCDKF1 | CDKF1 | 调控 | CDKF类丝氨酸蛋白激酶，磷酸化激活HlWRKY1 |
| Humulus lupulus | prenylflavonoid/bitter acids biosynthesis | HlWRKY5 | HlWRKY5 | 调控 | 与AtWRKY75同源，但组织表达模式不同于HlWRKY1 |
| Humulus lupulus | prenylflavonoid/bitter acids biosynthesis | HlWRKY2 | HlWRKY2 | 调控 | WRKY家族成员，组织特异性低 |
| Humulus lupulus | prenylflavonoid/bitter acids biosynthesis | HlWRKY3 | HlWRKY3 | 调控 | WRKY家族成员，主要在根中表达 |
| Nicotiana benthamiana | transient expression | AtWRKY75 | AtWRKY75 | 调控 | 拟南芥同源蛋白，在瞬时表达中能激活HlOmt1启动子 |
关键发现
- HlWRKY1在lupulin腺体中表达最高，其他组织很低（根部为腺体水平的18%）
- HlWRKY1与HlWDR1和p19共表达时，对HlOmt1启动子的激活显著增强，p19和HC-Pro分别使激活提高约6倍和7倍
- 在转基因啤酒花中，HlWRKY1表达水平达对照的4318%~25704%，转基因株系中Omt1、Chs_H1、Vps、Prt1L转录水平显著升高
- 生物弹击实验中，PPrt1、PPrt2、POmt1分别平均产生4.5、6.3、16个蓝斑/叶，35S阳性对照96个
- HlWRKY1与HlCDKF1共表达使GUS活性增加43.7±15.2%。
研究结论
HlWRKY1是啤酒花lupulin生物合成调控网络的重要组分，通过激活结构基因启动子调控黄腐酚和苦味酸最后步骤，其表达受PTGS和蛋白激酶调节，可能参与植物花和种子保护。