A tandem array of UDP-glycosyltransferases from the UGT73C subfamily glycosylate sapogenins, forming a spectrum of mono-and bisdesmosidic saponins
- 作者
- Pernille Østerbye Erthmann, Niels Agerbirk, Søren Bak
- 单位
- Department of Plant and Environmental Sciences, University of Copenhagen
- 杂志
- Plant Molecular Biology（2018）
- DOI
- 10.1007/s11103-018-0723-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定 Barbarea vulgaris 中负责皂苷多样化糖基化的 UDP-糖基转移酶，解释单糖基和双糖基皂苷的形成机制，并探索相关 UGT73C 亚家族的基因组组织与进化。
研究策略
挖掘 B. vulgaris 转录组获得 19 个全长 UGT 候选基因，结合基因组序列额外发现 UGT73C27 共 20 个候选，通过在本氏烟草中瞬时表达分池筛选，随后在大肠杆菌中异源表达单个 UGT 并进行体外酶活分析；利用 LC-MS 鉴定产物，结合系统发育、基因组定位和正选择分析阐明进化关系。
核心内容
本研究从 Barbarea vulgaris 转录组中挖掘出20个全长UDP-糖基转移酶候选基因，通过本氏烟草瞬时表达分池筛选和大肠杆菌异源表达，结合体外酶活分析与LC-MS鉴定，系统解析了UGT73C亚家族成员在三萜皂苷糖基化中的功能。结果显示，6个UGT73C成员（BvUGT73C21/22/23/25/26/27）均能以10 μM齐墩果酸或常春藤皂苷元为底物进行糖基化，但产物谱各异：BvUGT73C21/26仅糖基化3位，BvUGT73C27主要修饰3位，BvUGT73C22主要修饰28位并可生成3,28-二糖苷，BvUGT73C23可直接从皂苷元生成双糖基皂苷，BvUGT73C25则在不同底物下呈现3/28位产物比例的变化。此外，所有6个酶均能在100 μM 24-表芸苔素内酯存在下将其糖基化成四种单葡萄糖苷产物。基因组分析发现BvUGT73C21/22/23/26与已知BvUGT73C11在pseudomolecule 3上串联排列，正选择位点（占密码子3.6–7.1%）定位于蛋白质溶剂暴露表面。研究未检测到将3-葡萄糖苷转化为纤维二糖苷的酶活性，提示该结构可能经由28位或双糖基中间体的间接途径合成。这些发现表明UGT73C亚家族通过串联重复和亚功能化产生了单糖基与双糖基皂苷的多样性，为阐明皂苷结构多样性的进化机制和生物合成途径提供了关键酶学证据。
创新点
发现 6 个 UGT73C 成员能够糖基化皂苷元，其中 4 个（BvUGT73C21/22/23/26）与已知 BvUGT73C11 形成串联排列，且部分成员能有效形成双糖基皂苷；未发现催化 3-葡萄糖苷加糖生成纤维二糖苷的酶，挑战了原有直接途径假设；正选择位点分布于蛋白质表面，提示可能参与底物进入或蛋白互作。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli (异源表达); Nicotiana benthamiana (瞬时表达) | 三萜皂苷生物合成 | BvUGT73C11 | BvUGT73C11 | 催化 | 已知皂苷元 3-O-葡萄糖基转移酶，本研究中作为对照及产生 3-葡萄糖苷底物 |
| Escherichia coli; Nicotiana benthamiana | 三萜皂苷生物合成 | BvUGT73C13 | BvUGT73C13 | 催化 | 已知皂苷元 3/28-O-葡萄糖基转移酶，作为系统发育参照 |
| Escherichia coli; Nicotiana benthamiana | 三萜皂苷生物合成 | BvUGT73C21 | BvUGT73C21 | 催化 | 新鉴定，仅糖基化皂苷元 3 位 |
| Escherichia coli; Nicotiana benthamiana | 三萜皂苷生物合成 | BvUGT73C26 | BvUGT73C26 | 催化 | 新鉴定，仅糖基化皂苷元 3 位 |
| Escherichia coli; Nicotiana benthamiana | 三萜皂苷生物合成 | BvUGT73C27 | BvUGT73C27 | 催化 | 新鉴定，主要糖基化 3 位，少量 28 位 |
| Escherichia coli; Nicotiana benthamiana | 三萜皂苷生物合成 | BvUGT73C22 | BvUGT73C22 | 催化 | 新鉴定，主要糖基化 28 位，少量 3 位，可形成 3,28-二糖苷 |
| Escherichia coli; Nicotiana benthamiana | 三萜皂苷生物合成 | BvUGT73C23 | BvUGT73C23 | 催化 | 新鉴定，糖基化 3、28 及 23 位（后者仅常春藤皂苷元），优先形成双糖基皂苷 |
| Escherichia coli; Nicotiana benthamiana | 三萜皂苷生物合成 | BvUGT73C25 | BvUGT73C25 | 催化 | 新鉴定，底物依赖的 3/28 位糖基化；该克隆存在 C 端 29 aa 延伸（可能是人工突变） |
| Nicotiana benthamiana (瞬时表达) | 三萜皂苷生物合成 | BvLUP5-G | BvLUP5-G (β-amyrin 合酶) | 催化 | 环化 2,3-氧化鲨烯生成 β-香树脂素，用于共表达产生皂苷元前体 |
| Nicotiana benthamiana (瞬时表达) | 三萜皂苷生物合成 | BvCYP716A81 | BvCYP716A81 (细胞色素 P450) | 催化 | 在 β-香树脂素 C28 位羟基化生成齐墩果酸 |
关键发现
- 筛选了 20 个 UGT 基因，其中 6 个（BvUGT73C21、22、23、25、26、27）均能以 10 μM 皂苷元（齐墩果酸、常春藤皂苷元）为底物进行糖基化，但产物谱不同：BvUGT73C21/26 仅糖基化 3 位
- BvUGT73C27 主要 3 位，少量 28 位
- BvUGT73C22 主要 28 位，少量 3 位，并可从 3-葡萄糖苷进一步生成 3,28-二糖苷
- BvUGT73C23 能从皂苷元直接生成双糖基皂苷，且当底物为常春藤皂苷元时还形成 3,23-二糖苷
- BvUGT73C25 在齐墩果酸底物下 3/28 位产物等量，在常春藤皂苷元下 3 位产物为主。所有 6 个酶在 100 μM 24-表芸苔素内酯下均能将其糖基化成四种单葡萄糖苷产物。基因组中 BvUGT73C21/22/23/26 与 BvUGT73C11 串联排列于 pseudomolecule 3（另有 13 kb 未解区域可能含 BvUGT73C25/27/13）。正选择分析表明 3.6–7.1% 的密码子具有 ω>1（模型3中 11 个位点、模型8中 2 个位点），建模定位在蛋白质溶剂暴露表面。未检测到将 3-葡萄糖基皂苷转化为相应纤维二糖苷的活性。
研究结论
B. vulgaris 的皂苷糖基化酶库比预期更丰富；UGT73C 亚家族通过串联重复和亚/新功能化贡献了皂苷单糖基与双糖基结构多样性。未发现纤维二糖苷合酶提示其生物合成可能通过间接途径（如先形成 28-位或双糖基中间体）。正选择位点位于蛋白表面，支持代谢通道或蛋白互作在底物特异性中起作用的假说。